人牙源性iPSCs分化心肌細(xì)胞促進急性心肌梗死小鼠心肌修復(fù)的研究

譚小兵，王儒仙，呂美榮，孫顯鳳，呂娜英，戴青原△

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是世界范圍內(nèi)死亡的首要病因［1］。AMI時有超過1×109的心肌細(xì)胞（cardiomyocytes，CMs）死亡，導(dǎo)致不可逆性心肌損傷，治療方式包括溶栓、冠狀動脈介入、冠狀動脈搭橋術(shù)等，晚期唯一選擇是心臟移植，但常缺乏足夠的移植器官，還有免疫排斥問題［2］，迫切需要新的治療方法。近年來干細(xì)胞領(lǐng)域的進展為AMI 治療提供了新的思路，尤其是誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。iPSCs 與胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的生物學(xué)性能相似，無倫理和免疫排斥問題，是組織再生的理想來源。牙源性組織取材方便，重編程效率高，已有將其成功誘導(dǎo)為iPSCs 的報道［3］。心肌再生修復(fù)可能需要干細(xì)胞、支架、組織工程和細(xì)胞因子或生長因子的聯(lián)合應(yīng)用［4］。研究證實干細(xì)胞可明顯改善AMI后的心臟功能［5］，但人牙源性iPSCs-CMs 用于AMI 修復(fù)的研究較少。本研究將人牙源性iPSCs-CMs注射到AMI動物體內(nèi)，評估其對受損心肌的修復(fù)效果，為AMI的干細(xì)胞治療提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人根尖乳頭干細(xì)胞（stem cells from apical papilla，SCAP）由本課題組培養(yǎng)凍存，BALB/C雄性SPF級7周齡小鼠9 只，體質(zhì)量20～23 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004；4 周齡CB-17 SCID雄性SPF級小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006；α-MEM 培養(yǎng)基、0.5 mmol/L EDTA、胎牛血清、vitronectin、CytoTune-iPS 2.0 仙臺病毒重編程試劑盒購自美國Invitrogen，PSCeasy 人多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)基、repro-easy 重編程培養(yǎng)基、CardioEasy 人心肌細(xì)胞分化試劑盒購自北京賽貝生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor488羊抗鼠IgG二抗購自美國Life，鼠抗人肌鈣蛋白T（troponin T，TNNT-2）單克隆抗體購自美國Santa Cruz，鼠抗人α-輔肌動蛋白（α-actinin）單克隆抗體購自美國Sigma，HE 染色試劑盒購自北京華越洋生物，熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss，16 通道多導(dǎo)生理記錄儀MP160購自美國BIOPAC，飛利浦超聲診斷系統(tǒng)S8-3購自荷蘭皇家飛利浦公司。

1.2 細(xì)胞重編程 常規(guī)復(fù)蘇SCAP，完全培養(yǎng)液（α-MEM+10%胎牛血清+1%L-谷氨酰胺+1%青/鏈霉素）培養(yǎng)，取4×104個細(xì)胞重新鋪板，按照文獻［6］進行細(xì)胞重編程。細(xì)胞加入預(yù)先配制的KOS/hc-Myc/hKlf4 混合液，37 ℃恒溫轉(zhuǎn)染24 h，連續(xù)培養(yǎng)1 周。消化收集已轉(zhuǎn)染的SCAP，重新鋪板（vitronectin 包被），更換為repro-easy 重編程培養(yǎng)基，每日換液。克隆形成后十字法挑選進行傳代培養(yǎng)，1 周可達到80%融合，EDTA傳代擴增用于后續(xù)實驗。

1.3 畸胎瘤實驗 為檢測獲得的iPSCs體內(nèi)多向分化潛能，iPSCs細(xì)胞生長至90%融合時消化，1 000 r/min離心5 min，收集沉淀。PBS 重懸后注射于CB-17 SCID 雄鼠皮下（1×107細(xì)胞/只），2～3個月成瘤后收集瘤體，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，石蠟包埋、切片，HE染色。

1.4 iPSCs心肌定向分化

1.4.1 誘導(dǎo)分化 根據(jù)生產(chǎn)商說明配制心肌分化完全培育基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液，平衡至室溫。iPSCs 細(xì)胞生長至80%融合時吸去原液，PBS清洗，加入2 mL心肌分化Ⅰ液，48 h后吸去舊液，PBS清洗后加入心肌分化Ⅱ液；48 h后更換為心肌分化Ⅲ液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)，每48 h 更換培養(yǎng)液，直至觀察到細(xì)胞搏動。

1.4.2 心肌細(xì)胞鑒定 收集搏動區(qū)域細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100處理1 h，5%脫脂牛奶孵育2 h，TNNT-2（1∶200）和α-actinin（1∶200）一抗孵育，加入Alexa Fluor488二抗常溫孵育，胞核DAPI染色，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5 AMI受損心肌修復(fù)的動物實驗

1.5.1 實驗分組 9 只BALB/C 雄性小鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組（不干預(yù)）、AMI 組（AMI 造模）和實驗組（AMI 造模+iPSCs-CMs注射），每組3只。

1.5.2 AMI建模 小鼠局麻后頸部正中切口，22 G針穿入氣管，連接人工呼吸機，左胸4～5 肋間進入胸腔，分離心包膜，于主動脈根部4～5 mm、肺動脈與左心耳間8-0縫線穿過冠狀動脈左前降支結(jié)扎，遠(yuǎn)端呈現(xiàn)暗紅色提示成功，逐層縫合胸腔，多導(dǎo)生理記錄儀行心電圖即刻描記。

1.5.3 細(xì)胞移植 收集人SCAP-iPSCs-CMs，PBS 重懸后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為2×107/mL，術(shù)后30 min將20 μL懸液注射到梗死心肌區(qū)域周圍，關(guān)閉胸腔、逐層縫合。恢復(fù)自主呼吸后拔出插管，嚴(yán)密縫合，肌內(nèi)注射20 000 U青霉素，單籠飼養(yǎng)。

1.5.4 心功能評估 術(shù)后第15天行超聲心動圖檢查，記錄左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVDs）、左心室舒張末期容積（LEDV）、左心室收縮末期容積（LESV），計算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）。LVEF=（EDV-ESV）/EDV；LVFS=（LVDd-LVDs）/LVDd×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.02 軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Games Howell檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人SCAP-iPSCs 的鑒定 復(fù)蘇培養(yǎng)的人SCAP呈典型的成纖維細(xì)胞樣，重編程第18～20 天形成小的圓形克隆，第23天克隆逐漸成熟，邊緣銳利、細(xì)胞大小基本一致，核漿比大，呈典型胚胎干細(xì)胞樣克隆形態(tài)，提示細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，見圖1A～C。SCID小鼠皮下注射iPSCs 8 周可形成明顯腫瘤，HE 染色可見腫瘤包含內(nèi)胚層、外胚層和中胚層組織，提示iPSCs細(xì)胞有良好分化潛能，見圖1D～F。

2.2 iPSCs 分化心肌細(xì)胞的鑒定 iPSCs 心肌誘導(dǎo)分化1周左右聚集形成團簇，期間多數(shù)細(xì)胞死亡，第8 天可觀察到細(xì)胞簇自主搏動，免疫熒光染色可見TNNT2和α-actinin表達陽性，見圖2。

2.3 3 組小鼠心功能比較 冠狀動脈結(jié)扎術(shù)建立AMI 小鼠模型，術(shù)中2 只小鼠死亡，均予以重新補充。術(shù)后即刻心電圖描記可見高聳T 波和ST 段抬高，見圖3A。超聲心動圖檢查呈現(xiàn)典型的左心室重構(gòu)特征，表現(xiàn)為左心室心腔擴大（LVDd 和LVDs 增加），左心室收縮能力減弱（LVEF 和LVFS 減小），提示AMI動物模型制備成功，見圖3B～D。術(shù)后超聲心動圖檢查顯示，AMI 組LVEF 和LVFS 明顯小于正常組，實驗組LVEF 和LVFS 明顯大于AMI 組，但均低于正常組，見圖4。

3 討論

Fig.1 Reprogramming process of human SCAP-iPSCs and teratoma assay圖1 人SCAP-iPSCs重編程過程及畸胎瘤實驗

Fig.2 Immunofluorescence staining of differentiated hiPSCs-CMs(×400)圖2 人SCAP-iPSCs分化心肌細(xì)胞標(biāo)志物免疫熒光染色（×400）

Fig.3 AMI model and echocardiography results after CMs injection of the three groups圖3 AMI動物模型及細(xì)胞注射后3組超聲心動圖檢查結(jié)果

Fig.4 Comparison of echocardiography results after CMs injection between the three groups圖4 細(xì)胞注射后3組超聲心動圖檢查結(jié)果比較

iPSCs重編程來源細(xì)胞獲取方式多為有創(chuàng)性，人牙源性細(xì)胞來源于拔除牙齒或種植手術(shù)的廢棄組織，取材方便、重編程效率高［7］。本研究采用的仙臺病毒重編程系統(tǒng)不與目標(biāo)細(xì)胞DNA結(jié)合，避免DNA插入突變和病毒再激活，同時采用無異源性動物成分的鋪底液作為支持層，增加了iPS細(xì)胞的生物安全性。本研究采用的iPSCs心肌分化培養(yǎng)基成分明確、步驟簡單高效，誘導(dǎo)分化得到的心肌細(xì)胞可自主搏動，且特異性表達心肌標(biāo)志物TNNT-2和α-actinin，經(jīng)純化后TNNT-2 陽性細(xì)胞比例可超過90%（其余為未分化或分化中iPSCs），為后期動物實驗提供了可靠的細(xì)胞來源。采用經(jīng)典的冠狀動脈左前降支結(jié)扎法構(gòu)建的AMI 小鼠模型，實驗小鼠術(shù)后2 只發(fā)生死亡，可能為胸腔縫合不嚴(yán)密導(dǎo)致氣胸死亡。分化心肌細(xì)胞注射到動物梗死心肌周圍發(fā)現(xiàn)可以明顯促進小鼠超聲指標(biāo)的改善，證實人牙源性iPSCs分化心肌細(xì)胞可以明顯促進AMI 時受損心肌的修復(fù)，為AMI的干細(xì)胞治療提供了新的思路。

干細(xì)胞用于心血管疾病的治療可分為幾個階段［8］。第一代細(xì)胞是成體來源，包括骨骼肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞、MSCs等，心內(nèi)膜注射效果最佳［9］，這也是本研究采取心內(nèi)膜注射的原因。第二代是有心肌分化潛能的干細(xì)胞，包括心臟干/祖細(xì)胞、ESCs、iPSCs等。Menasché 等［10］首次將ESCs 植入重度心衰患者體內(nèi)梗死區(qū)域附近，術(shù)后心功能顯著改善，LVEF 增加了10%。但ESCs的致瘤性、免疫原性和倫理問題限制了其臨床應(yīng)用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人牙源性iPSCs-CMs 注射后實驗組小鼠的LVEF 和LVFS 均有明顯改善，提示細(xì)胞注射對受損心肌的修復(fù)效果。Funakoshi 等［11］將人iPSCs-CMs 注射到AMI 裸鼠梗死區(qū)域周圍，術(shù)后LVFS 明顯改善，左心室梗死面積縮小，與本研究結(jié)果一致，但該研究采用擬胚小體法誘導(dǎo)形成心肌細(xì)胞，分化培養(yǎng)基成分復(fù)雜、步驟繁瑣，誘導(dǎo)時間較長。本研究采用成分明確、操作簡單的分化培養(yǎng)基，Ⅰ液推動iPSCs 向中胚層轉(zhuǎn)化，Ⅱ液誘導(dǎo)形成心臟中胚層，Ⅲ液使心臟細(xì)胞成熟，最早第8天即發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞搏動。Jiang 等［12］采用商品化人iPSCs-CMs 進行研究，得到相似結(jié)果。Shiba等［13］采用相同的方法對長尾獼猴AMI 模型進行實驗后發(fā)現(xiàn)，術(shù)后也可明顯促進受損心肌的收縮功能，但會發(fā)生室性心動過速。移植干細(xì)胞在受損心肌內(nèi)發(fā)揮修復(fù)作用的可能機制：（1）移植干細(xì)胞直接分化為心肌細(xì)胞。（2）旁分泌效應(yīng)促進周圍心肌細(xì)胞的增殖。（3）激活內(nèi)源性心肌干細(xì)胞。（4）促進移植細(xì)胞和宿主心肌細(xì)胞的融合［14］。

干細(xì)胞移植存留量直接影響治療效果。Ye等［15］將人iPSCs-CMs、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞與裝載胰島素樣生長因子（IGF）微球的3D纖維蛋白貼片植入豬心肌梗死區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞與宿主心肌融合產(chǎn)生有序肌節(jié)結(jié)構(gòu)，可以改善左心室功能。Li 等［16］研發(fā)了一種包裹人iPSCs-CMs 的可注射性AuNP-透明質(zhì)酸凝膠，移植到AMI 小鼠體內(nèi)可明顯促進心肌縫隙連接和心室電傳導(dǎo)的再同步化，有利于心肌修復(fù)。干細(xì)胞治療用于誘導(dǎo)心肌修復(fù)有巨大的臨床應(yīng)用前景，但需要解決以下幾個問題：一是細(xì)胞的移植效率，可聯(lián)合應(yīng)用生物支架和三維細(xì)胞打印技術(shù)［17］。二是安全問題，主要包括腫瘤和心律失常的發(fā)生。本研究僅對人iPSCs-CMs標(biāo)志物進行了分析，未將其電生理特性與成熟心肌細(xì)胞進行對比。本研究時間段未發(fā)現(xiàn)宿主體內(nèi)腫瘤的發(fā)生，應(yīng)進一步延長觀察時間，確保臨床應(yīng)用的安全性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)人牙源性iPSCs分化心肌細(xì)胞局部注射可以明顯改善AMI小鼠的左心室泵血功能和心肌收縮性能，為AMI 的干細(xì)胞治療提供了新的依據(jù)。