紫色甘薯資源的形態學和ISSR熒光標記分析

吳巧玉，何天久

(貴州省農業科學院生物技術研究所，貴陽 550006)

0 引 言

【研究意義】紫色甘薯富含花青素[1-2]。紫色甘薯的主要用途為鮮食、提取色素、加工全粉和加工休閑食品等[3]。貴州省紫色甘薯品種來源分為本地選育和引進。作物的生長發育受環境及固有基因相互影響，一些引進的紫色甘薯在貴州種植時產量、品質等性狀可能會出現不同程度差異，對引進的紫色甘薯新品種開展生物學形態鑒定和分子生物學鑒定，篩選適宜品種及親本，對發展貴州省紫色甘薯具有重要意義。【前人研究進展】黃萍等[4]分析對貴州地方品種及引進品種形態聚類，宋吉軒等[5]對貴州紫心甘薯進行形態標記聚類分析，李慧峰等[6]對廣西地方甘薯品種進行形態標記分類。采用形態學來區分遺傳變異和種屬之間的差別方法最直接簡便，但是形態學研究方法具有一定的局限性，容易受到人為因素和環境因素的影響，難以區分親緣關系較近的材料，需結合其他方法對材料進行親緣關系分析[7-8]。ISSR分子標記技術具有引物設計容易，操作簡單，多態性好，可重復性高等優點，在作物種質資源鑒定、分類及親緣關系分析等中有重要的應用[9]。ISSR技術具有較高的分辨力，在賀學勤等[10]、李強等[11]的甘薯遺傳多樣性研究中得到肯定。【本研究切入點】近年來，對甘薯種質資源進行的研究，多是利用形態學性狀對甘薯種質資源進行鑒定分類，盡管分子標記在品種鑒別上發揮重要作用, 但目前分子標記仍未能取代形態學性狀, 將兩者結合起來更利于品種之間的遺傳關系。目前國內少見利用形態學及分子標記同時對紫色甘薯親緣關系進行綜合分析。需分析紫色甘薯品種的遺傳多樣性，其遺傳差異。【擬解決的關鍵問題】利用形態學性狀和ISSR熒光標記，分析引進的10份紫色甘薯品種進行遺傳多樣性，為貴州省紫色甘薯種質資源新品種選育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為從西南大學引進7份紫色甘薯，山東引進2份，江蘇引進1份，種植于貴州省農科院生物技術研究所試驗基地。表1

表1 甘薯材料名稱及來源

1.2 方 法

1.2.1 形態學表型性狀調查

材料于2020年5月在貴州省農科院試驗基地種植，每個品種以10株為樣本, 按農業行業標準 NY/T 2939-2016[12]觀察、測量、記載20項形態學性狀，取平均值。

1.2.2 基因組DNA提取

參照李強等[11]的甘薯基因組 DNA 提取方法，DNA提取試劑盒(擎科生物通用型)。

1.2.3 引物篩選及PCR檢測

使用加拿大哥倫比亞大學公布的第9套ISSR引物序列，由擎科生物科技有限公司合成。

PCR擴增體系各組分：2×TSINGKE Master Mix(blue) 10 μL；10 μM Primer 1 μL；Template(gDNA)1 μL；ddH2O 8 μL。擴增程序：預變性1個循環(94℃ 5 min); 循環階段35個循環(94℃30s，TM℃ 30s, 72℃ 30s)；延伸階段1個循環(72℃ 5 min)。擴增產物在3730測序儀(ABI 3730xl遺傳分析儀)進行毛線管電泳，篩選出多態性較好的位點。

1.3 數據處理

形態學聚類分析采用唐啟義等[13]方法基于運用DPS 數據處理系統，歐式距離和類平均法(UPGMA)進行聚類分析。

遺傳多樣性分析在GenAlEx version 6.501和GenePop version 4.14軟件中，分別計算ISSR位點的各項遺傳多樣性指標，包括觀測等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、期望雜合度(He)、香農指數(I)。

ISSR聚類分析利用 NTSYSpc 2.1 軟件對10份供試材料進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 紫色甘薯形態學性狀測量、編碼結果、形態學聚類

研究表明，在歐式距離為9.97處，可分為獲得兩大類群，類群Ⅰ包括 5個品種，分別為鄂12、寧紫4號、渝紫3號、渝紫11、南紫018；類群Ⅱ可包括其余 5個品種，分別為寧紫1號、山東紫薯、渝紫2號、徐紫8號、越南紫薯。

類群Ⅰ被分為2個亞群，第一亞群3個品種，分別為鄂12、寧紫4號、渝紫3號；第二個亞群2個品種，分別為渝紫11和南紫018。類群Ⅱ主要形態特征為頂芽色和頂葉色紫/淡紫，頂葉葉緣色紫，葉尖性狀銳，葉色綠，節間長短，主蔓長短，薯皮薯肉紫/深紫。

類群Ⅱ被分為4個小類，其中寧紫1號和山東紫薯被聚在一起，兩者親緣關系較近。這一類群與第Ⅰ類群最大區別為葉脈全綠，第Ⅰ類群葉脈紫、部分紫、全部紫。表2，表3，圖1

表2 甘薯形態標記及編碼

表3紫薯甘薯形態指標測定

圖1 紫薯甘薯形態標記的聚類

2.2 紫色甘薯材料ISSR的多態性

研究表明，等位基因(Na)平均為2個；有效等位基因數(Ne)平均為1.919 0；期望雜合度(He)平均為0.237 5；香農指數(I)平均0.433 3。供試的紫色甘薯遺傳多樣性較豐富。表4

表4 引物序列及擴增條帶

2.3 紫色甘薯材料ISSR熒光標記的聚類

研究表明，在遺傳距離為 0.96處，供試材料可分為兩大類。類群Ⅰ包括6份材料，分別為：寧紫薯1號、鄂12、渝紫薯3、徐紫8號、山東紫薯；類群Ⅱ包括4個甘薯品種，分別是渝紫11、南紫018、寧紫薯4號、越南紫薯。

在遺傳距離為0.68處，類群Ⅰ被分為兩個亞類，第一個亞類寧紫薯1號、鄂12、渝紫薯3、渝紫薯2號；第二個亞類有徐紫8號和山東紫薯。其中鄂12和渝紫薯3，徐紫8號和山東紫薯被聚在一起，表現出更緊密的親緣關系。

在遺傳距離為0.46處，類群Ⅱ被分為兩個亞類，渝紫11、南紫018和寧紫薯4號為一個亞類，越南紫薯單獨為一個亞類。圖2

圖2 基于ISSR熒光標記的紫色甘薯聚類

3 討 論

形態學性狀的表現是基因型和環境互作的結果, 其最大特點是直觀性強，可區分不同的表型個體，在傳統育種過程中仍是主要的研究手段[14]。研究中大部分材料被形態學聚類圖上被聚到一類的材料在ISSR分子標記聚類圖上也被聚在一個類群中，如寧紫1號、山東紫薯、渝紫薯2號、徐紫8號在兩類聚類圖中都被聚在一個大類；寧紫4號、渝薯11、南紫018在兩類聚類圖中也被聚在一個大類。部分供試材料的形態學標記與ISSR標記聚類結果在類群劃分與遺傳背景上具有一致性。而越南紫薯、鄂12、渝紫3號這3份材料在兩類聚類圖種出現在不同類別。部分供試材料的形態學標記與ISSR標記聚類結果并不完全一致。劉洪等[15]研究認為，在理論上要完全尋找與形態學性狀高度相關的SSR 標記存在很大難度。許文停等[16]研究發現，湖南牡丹種質資源的形態學聚類結果與 ISSR 分子標記聚類結果并不完全一致；王鵬等[17]研究結果表明，部分馬鈴薯種質材料的形態學標記聚類結果與SSR標記聚類結果的表現不完全一致；劉洪等[15]通過 Mantel 檢驗發現，花生品種間的形態學性狀相似系數與 SSR 標記相似系數的相關性很弱。

研究中形態性狀聚類分析中，寧紫1號和山東紫薯被聚在一起，而在ISSR標記分析種將兩者分在不同亞類；在分子標記聚類圖中，南紫018和寧紫4號被聚在一起，在形態分析聚類聚圖中將兩者分在不同亞類。

4 結 論

在歐式距離為9.97處，可將10份紫色甘薯分為獲得兩大類群；在遺傳距離為 0.96處，供試材料可分為兩大類群。部分紫色甘薯供試材料的ISSR標記聚類結果與形態學標記在遺傳背景和類群劃分上具有一致性，但是兩種鑒定分類方法的聚類分析結果也存在一定差異，將形態學及ISSR標記結合能有效提高品種間特異性的鑒定，更能客觀、準確的確定種質資源的親緣關系。