eGFP標記狂犬病病毒G基因與EgM123基因重組融合蛋白的表達與鑒定

阿爾祖古麗·阿卜力孜， 胡美荷，王 楠，劉來珍，古麗妮尕爾·阿力普江，翟少華

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】犬科動物是狂犬病的主要宿主，同時又是囊型包蟲病的唯一終末宿主，對犬科動物進行免疫預防是控制這兩種疾病傳播的關鍵環(huán)節(jié)。通過反向遺傳學拯救EgM123基因重組狂犬病病毒，可為狂犬病和包蟲病二聯(lián)基因疫苗的研制提供基礎，實現(xiàn)從源頭控制狂犬病和包蟲病的傳播。【前人研究進展】狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一種動物源性人獸共患病[1]。該病呈全球流行[2]。口服疫苗對犬進行免疫，安全易行，實用方便、省時省力[3-4]。包蟲病又叫棘球蚴病，其成蟲細粒棘球絳蟲寄生于犬科類食肉動物的體內(nèi)，幼蟲細粒棘球蚴寄生于人和多種動物的肝臟和肺臟，導致多臟器內(nèi)形成細粒棘球蚴包囊[5-6]。將Eg95抗原作為疫苗免疫中間宿主羊取得了很好的進展[7-9]。【本研究切入點】針對終末宿主犬的研究進展較緩慢。犬是作為細粒棘球絳蟲的終末宿主，在包蟲病的傳播中起關鍵性作用[10]。犬作為狂犬病和包蟲病的傳播媒介，對犬進行免疫是控制這兩種傳染病的關鍵環(huán)節(jié)。我國邊境牧區(qū)羊、牛等家畜狂犬病近年來迅速增加[11-14]。毛麗萍等[15]對EgM家族基因在蟲體不同發(fā)育時期mRNA表達進行分析發(fā)現(xiàn)，在成蟲階段，EgM4、EgM9、EgM123的表達較高，尤其是EgM123的表達量是EgM4、EgM9的2.5倍，這表明EgM123基因是細粒棘球絳蟲成蟲階段攜帶的主要基因，參與蟲卵成熟階段的調節(jié)或代謝方面有著重要的調控，可作為預防細粒棘球絳蟲成蟲侵襲的候選基因抗原。【擬解決的關鍵問題】將細粒棘球絳蟲EgM123基因和eGFP基因重組于狂犬病病毒G基因后序列，構建含有eGFP熒光報告基因的融合基因，實現(xiàn)構建的重組質粒pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP在真核細胞中表達，為通過反向遺傳學技術拯救“EgM123基因重組狂犬病病毒”和研制“狂犬病-包蟲病二聯(lián)基因疫苗”提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 載體，質粒，菌株及細胞株

pcDNA3.1(-)真核表達載體、pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重組質粒、BHK-21細胞均由獸醫(yī)病理實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(北京天根生化科技有限公司)；無內(nèi)毒素質粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；EcoRI、EcoRV限制性核酸內(nèi)切酶(美國NEB有限公司)；胎牛血清、細胞培養(yǎng)基DMEM、雙抗(以色列BI生物科技公司)；Lipo6000TM轉染試劑(上海碧云天生物技術有限公司)；RIPA細胞裂解液、廣譜蛋白酶抑制劑、GFP單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；RABV G蛋白單抗、HRP標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的兔抗狗IgG、HRP標記的山羊抗兔子IgG(北京博奧森生物技術有限公司)；犬源細粒棘球絳蟲EgM123基因多克隆抗體為新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所張壯志研究員贈送。

1.2 方 法

1.2.1 pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重組質粒的提取

將已構建并測序鑒定的pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重組質粒吸出1 μL加到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞里輕輕混勻冰上靜止30 min，42℃水浴放置90sec，冷卻2 min。再向離心管中加入900 μL無菌的LB培養(yǎng)基混勻置于37℃搖床震蕩培養(yǎng)45 min，吸取100 μL已轉化的感受態(tài)細胞均勻涂在LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，搖菌擴繁并按照OMEGA公司無內(nèi)毒素質粒提取試劑盒要求進行質粒提取，測定質粒濃度，進行PCR，雙酶切鑒定。

1.2.2 pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重組質粒的轉染

將BHK-21細胞鋪板于六孔板用10% FBS的DMEM在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，待細胞密度達80%時進行轉染。取兩個無菌的離心管分別加入500 μL不含抗生素和血清的DMEM培養(yǎng)液，其中一管加入10 μg pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重組質粒，輕輕混勻；另一管加入20 μL Lipo6000TM轉染試劑，輕輕混勻，室溫靜置5 min，將含有重組質粒的培養(yǎng)液加到含Lipo6000TM轉染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫靜置20 min。將混合物按照每孔250 μL的量均勻滴加到六孔板1～4孔內(nèi)，其余兩孔留作對照，十字法晃動混勻，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察是否出現(xiàn)綠色熒光。

1.2.3 SDS-PAGE電泳檢測G+EgM123+eGFP融合蛋白的表達

將轉染48 h后的六孔板棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗3次，每孔加入250 μL細胞裂解液，冰上靜置30 min，超聲破碎3 min，4℃，10 000 g離心10 min，取上清加到新的離心管。加入蛋白上樣緩沖液，100℃水煮10 min，4℃離心10 min，-20保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔加入20 μL蛋白樣品進行電泳，考馬斯亮藍染色液染色2 h，考馬斯亮藍脫色液過夜脫色，觀察蛋白表達情況。

1.2.4 Western blotting檢測G+EgM123+eGFP融合蛋白的表達

將變性后的G+EgM123+eGFP蛋白樣品按每孔20 μL加入聚丙烯酰胺凝膠孔中，其加樣順序為蛋白Marker、G+EgM123+eGFP蛋白，再重復此加樣順序兩次后，80V跑40min，120V跑至膠底，取出跑好的凝膠，按照蛋白Marker條帶大小切取100 KDa以上的位置，按照纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊依次放好，在恒流300 mA條件下轉移到0.45 μm的PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，再依著彩虹蛋白Marker條帶位置用剪刀剪成三段，將PVDF膜分別于RABV-G蛋白單抗(1∶500稀釋)、GFP單抗(1∶2000稀釋)和細粒棘球絳蟲EgM123多抗(1∶500稀釋)在4℃過夜孵育。TBST清洗3次，37℃分別孵育HRP標記的山羊抗兔子IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的兔抗狗IgG(1∶5000稀釋)2 h后，TBST清洗3次，曝光觀察抗原抗體結合結果。

2 結果與分析

2.1 狂犬病病毒G+EgM123+eGFP重組質粒的鑒定

研究表明，通過pcDNA3.1(-)載體通用引物擴增擴繁后的重組質粒菌液，菌液PCR結果顯示，在3 000 bp左右能擴增出目的片段條帶，與目的基因片段大小一致。使用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅤ/EcoRⅠ對構建的重組質粒pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP進行雙酶切。酶切后，重組質粒在5000 bp和3000 bp左右目的片段和載體成功切成兩條帶，與目的基因片段大小一致。將菌液PCR和雙酶切鑒定的重組質粒送去測序，測序結果正確。pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP真核表達載體構建成功，可用該質粒進行下一步的轉染。圖1，圖2

注：M：10 000 DNA Marker，1：狂犬病病毒G+EgM123+eGFP重組基因3 033 bp

注：M:15 000 DNA Marker，1：重組質粒，2～3：重組質粒酶切結果

2.2 熒光顯微鏡觀察eGFP表達

研究表明，將重組質粒pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP轉染BHK-21細胞48 h后，對照組正常細胞孔沒有出現(xiàn)綠色熒光，試驗組不同倍數(shù)下都能觀察到細胞質內(nèi)呈現(xiàn)的綠色熒光。eGFP標記的狂犬病病毒G基因重組細粒棘球絳蟲EgM123基因的融合蛋白G+EgM123+eGFP轉染成功并表達正確。圖3

A：正常細胞對照 B：48 h觀察結果(100×) C：48 h觀察結果(200×)

2.3 狂犬病病毒G+EgM123+eGFP融合蛋白表達

研究表明，將轉染后48 h的試驗孔和對照孔細胞同時進行裂解收取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳跑膠結果顯示，融合蛋白在120 KDa左右處存在明顯的蛋白表達條帶，而對照組正常細胞蛋白樣品沒有出現(xiàn)相應大小的蛋白表達條帶。為了進一步證明融合蛋白的表達，進行Western blot檢測。圖4

注：M，預染蛋白Marker；1，G+EgM123+eGFP融合蛋白2，正常BHK-21細胞蛋白；

2.4 Western blot檢測G、EgM123、eGFP蛋白表達鑒定

研究表明，G+EgM123+eGFP融合蛋白樣品分別與狂犬病病毒G蛋白抗體、細粒棘球絳蟲EgM123蛋白抗體和GFP蛋白抗體反應后能夠在與考馬斯亮藍染色結果相同位置處檢測出特異性條帶。3種蛋白分子量大小均為120 KDa左右，與預期蛋白大小相符。這些結果表明構建的真核表達質粒pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP能夠在真核細胞中成功表達且能夠特異性的識別融合蛋白中的鼠源、犬源和兔源抗體。圖5

注：M，預染蛋白Marker；1～3，G+EgM123+eGFP融合蛋白樣品；

3 討 論

病毒反向遺傳學技術，可以在基因水平上對病毒的基因組進行修飾，可刪除毒力相關基因，插入外源抗原基因，并通過病毒的拯救構建可攜帶外源基因的重組病毒，實現(xiàn)多重免疫目的[16-17]。增強型綠色熒光蛋白eGFP其大小為27 KDa，作為一種報告分子在監(jiān)測目的基因的表達、研究細胞內(nèi)物質代謝及追蹤細胞系分化等方面有著極其廣泛的應用。Zheng X[18]在表達eGFP的重組狂犬病病毒研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶eGFP基因的重組病毒在病毒傳代過程中可持續(xù)穩(wěn)定表達，且對病毒生長特性和復制并未產(chǎn)生影響。試驗對后面拯救的重組狂犬病病毒的復制并未產(chǎn)生影響。插入的另外一個外源基因細粒棘球絳蟲EgM123主要分布于成熟細粒棘球蚴絳蟲的睪丸中，調節(jié)精子的產(chǎn)生和受精后表達一種蟲卵膜蛋白[19]。為了實現(xiàn)狂犬病病毒G基因和細粒棘球絳蟲EgM123基因的共同表達和檢測是否表達，構建了融合蛋白G+EgM123+eGFP[20]。經(jīng)轉染并在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有綠色熒光出現(xiàn)，通過SDS-PAGE電泳對G+EgM123+eGFP蛋白進行檢測，并未發(fā)現(xiàn)三種蛋白單獨表達，而在融合蛋白120 KDa處出現(xiàn)明顯表達的條帶，構建的狂犬病病毒G+EgM123+eGFP蛋白融合成功并在細胞內(nèi)有表達。經(jīng)Western-blot檢測G、EgM123、eGFP蛋白的免疫原性，發(fā)現(xiàn)3種蛋白抗原在融合蛋白120KDa處與抗體結合出現(xiàn)了明顯的抗原抗體結合條帶，構建的融合蛋白對G、EgM123、eGFP蛋白的免疫原性沒有影響。

4 結 論

表達出了eGFP標記的狂犬病病毒G基因重組細粒棘球絳蟲EgM123基因的融合蛋白，通過SDS-PAGE電泳對表達蛋白進行分析結出了狂犬病病毒G+EgM123+eGFP蛋白是融合蛋白并利用Western blotting 證明了外源蛋白的表達及免疫原性。