膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平變化及其臨床價值*

廖文超，錢 駿，王朋飛，方克寶

江油市人民醫院重癥醫學科，四川綿陽 621700

因感染引發抗炎、促炎反應調節失常的全身炎癥反應綜合征稱為膿毒癥，隨著病情發展，可出現膿毒性休克、多器官功能衰竭，進而危及膿毒癥患者生命健康[1]。有研究表明，全球每年膿毒癥患者約有1 900萬，且患病年齡段趨向于年輕化，增加了家庭和社會的經濟負擔[2-3]。臨床對引起膿毒癥的各種細胞因子的研究結果表明，膿毒癥與多種細胞基質異常密切相關，微小RNA-23b(miR-23b)作為新發現的微小RNA(miRNA)，能調控各種信號通路，刺激炎癥細胞分泌炎癥因子，進而參與膿毒癥的發生、進展[4-5]；微小RNA-146a(miR-146a)作為可影響機體免疫系統的miRNA，其主要調控內毒素耐受機制，當其分泌量增多時，可造成內毒素過度表達，進而加速膿毒癥病情發展[6]。吲哚胺-2，3-雙加氧酶(IDO)作為一種色氨酸代謝限速酶，主要由臟器淋巴、胸腺髓質分泌，可使色氨酸水平下降，從而對T細胞增殖、凋亡造成影響[7-8]。國內外對miR-146a、miR-23b、IDO在膿毒癥中表達的研究多為單一分析研究，聯合檢測這3項指標在膿毒癥中的表達水平并分析其臨床價值的研究少見?；诖耍疚膶@3項指標在膿毒癥患者中的表達水平及臨床價值進行研究，為膿毒癥的診斷、治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年1月本院重癥監護病房(ICU)收治的105例膿毒癥患者作為膿毒癥組，另選擇本院同期103例體檢健康者作為對照組。納入標準：所有研究對象無其他免疫性疾病，無心臟疾病，具有生活自理能力；膿毒癥組符合《膿毒癥中西醫結合診治專家共識》[9]中的診斷準則，體溫>38.3 ℃，心率90次/分，低血壓情況嚴重，伴有低氧血癥、急性少尿;對照組體檢指標正常，無膿毒癥癥狀。排除標準：處于瀕死狀態的患者；合并器官移植、惡性腫瘤的患者；具有酗酒、熬夜不良習慣的患者；近期使用激素治療的患者。膿毒癥組與對照組性別、年齡、體質量指數(BMI)、血液黏度比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。按病情嚴重程度從輕到重將膿毒癥分為3種類型：膿毒癥為僅有全身炎癥反應綜合征；嚴重膿毒癥為膿毒癥伴有其所致的器官功能障礙和(或)低血壓；膿毒性休克為感染引起的嚴重低血壓且補液效果差。膿毒癥組中有膿毒癥36例，嚴重膿毒癥34例，膿毒性休克35例。本研究獲本院醫學倫理委員會審核批準，所有研究對象或其家屬均知曉本研究并簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法

1.2.1標本采集 采集對照組體檢當天和膿毒癥組入院次日空腹靜脈血9 mL，以3 000 r/min離心12 min，收集血清，將血清置于5 ℃低溫箱中保存、待檢。

1.2.2miR-23b、miR-146a檢測 采用熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測兩組miR-23b、miR-146a水平，檢測方法：(1)總RNA提取。將保存的血清標本使用Trizol試劑提取總RNA，并使用核酸蛋白檢測儀進行濃度檢測。(2)cDNA合成。采用全式金公司TransScript?Ⅱ Reverse Transcriptas試劑盒方法，建立反應體系，包括總RNA 5 μL、RT反應緩沖液(10×)為2 μL、高質量(HPLC級別)dNTPs 1 μL、MMLV 1 μL、隨機引物1 μL、補充無核酸酶水至20 μL。反應條件為50 ℃，30 min。(3)qPCR。采用全式金公司TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒方法，建立反應體系，包括cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL、SYBR Green qPCR mix 10 μL，補充無核酸酶水至20 μL。以U6為內參，U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-23b上游引物為5′-GATGTGTATCCTCAGAGCTTTG-3′，下游引物為5′-CGATGACAGAGATATCCCAG-3′；miR-146a上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGG-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTGCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTA ATCC-3′。PCR反應條件為預變性94 ℃ 1 min，94 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45個循環，72 ℃終末延伸6 min。(4)建立熔解曲線。在94 ℃、反應時間為60 s，接著在55～96 ℃，進行熔解，緩慢提升溫度，每個反應各溫度滯留35 s，重復45次，待反應結束，用電腦繪制熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計算miR-23b、miR-146a的相對表達量。PCR儀器采用Gentier 96E全自動醫用PCR分析系統(西安天隆科技有限公司)。

1.2.3IDO檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IDO，檢測方法：冰箱取出人IDO ELISA試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司)，置于室溫下30 min；據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數，每個標準品和血清標本都做復孔。按照試劑盒說明書要求的比例稀釋標準品，加入稀釋好的標準品50 μL于標準品反應孔中，血清標本和樣品稀釋液1∶1稀釋后加50 μL于樣品反應孔中，每個反應孔加入50 μL的生物素標記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內液體，洗滌緩沖液清洗酶標板孔3次。然后每孔加入50 μL的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。甩去孔內液體洗滌緩沖液清洗酶標板孔3次。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育10 min。避免光照。取出酶標板，每孔加入50 μL終止溶液，終止反應；通過酶標儀(Multiskan FC 酶標儀，賽默飛世爾科技公司)在450 nm波長測定各孔的吸光度值。

1.2.4指標觀察 統計所有研究對象的miR-23b、miR-146a、IDO水平。隨訪28 d時膿毒癥患者的預后情況，并根據預后情況將患者分為存活組和死亡組。比較膿毒癥組與對照組、不同病情嚴重程度和不同預后膿毒癥患者的miR-23b、miR-146a、IDO水平，分析miR-23b、miR-146a、IDO單獨和聯合檢測診斷膿毒癥的效能及這3項指標間的相關性。

2 結 果

2.1膿毒癥組和對照組血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比較 與對照組比較，膿毒癥組血清miR-146a、IDO水平升高，miR-23b水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 膿毒癥組和對照組血清miR-23b、miR-146a、IDO指標比較

2.2不同病情嚴重程度膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比較 不同病情嚴重程度膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，而且隨著膿毒癥病情嚴重程度加重，miR-146a、IDO水平逐漸升高，miR-23b水平逐漸降低，見表3。

表3 不同病情嚴重程度膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比較

2.3不同預后膿毒癥患者miR-23b、miR-146a、IDO水平比較 經隨訪，28 d時膿毒癥患者死亡14例，存活91例。膿毒癥患者死亡組miR-146a、IDO水平高于存活組，miR-23b水平低于存活組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同預后膿毒癥患者miR-23b、miR-146a、IDO水平比較

2.4血清miR-23b、miR-146a、IDO水平間的相關性 相關性分析結果顯示，miR-23b水平與miR-146a、IDO均呈線性負相關(r=-0.618、-0.623，P<0.001)，miR-146a水平與IDO呈線性正相關(r=0.552，P<0.001)，見圖1。

注：A為miR-23b水平與miR-146a間關系散點圖；B為IDO水平與miR-23b間關系散點圖；C為miR-146a水平與IDO間關系散點圖。

2.5血清miR-23b、miR-146a、IDO單獨和聯合檢測對膿毒癥的診斷效能 ROC曲線分析顯示，血清miR-23b、miR-146a、IDO聯合檢測診斷膿毒癥的曲線下面積(AUC)為0.846，高于miR-23b、miR-146a、IDO單項檢測診斷膿毒癥的0.796、0.808、0.734，差異均有統計學意義(P<0.05)；當約登指數最大時，miR-23b、miR-146a、IDO對應的最佳臨界值分別為1.68、2.98、17.35 ng/L。見表5。

表5 血清miR-23b、miR-146a、IDO單獨和聯合檢測診斷膿毒癥的效能

3 討 論

膿毒癥是因感染引起的全身炎癥反應綜合征，可造成急性多器官功能障礙或在膿毒癥的基礎上出現補液難以糾正的低血壓等癥狀，其發生的主要原因是嚴重燒傷、創傷、外科大手術后感染、缺血再灌注損傷等[10]。miR-23b是具有調節作用的miRNA，其具有調控基因表達及健康穩態細胞促氧化、抗氧化的能力，其分泌量下降會增強炎癥反應，促進細胞黏，造成患者病情進一步惡化[11]。miR-146a可刺激白細胞介素-1受體相關激酶、腫瘤壞死因子受體相關因子6表達水平上升，加劇炎癥反應，影響患者病情恢復[12]。IDO使色氨酸水平下降，進而對T細胞的增殖、凋亡及活性造成損害，并影響膿毒癥治療結局[13]。本研究檢測ICU膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平，為膿毒癥診斷、治療提供參考依據。

miRNA作為內源性短鏈非編碼RNA，可與特異性RNA靶向結合，發揮降解、抑制靶基因的轉錄及翻譯功能的作用[14]。有研究表明，miR-23b通過激活TAB2蛋白活性，在自身免疫缺陷疾病中發揮抑制炎癥反應作用，并可影響炎癥細胞分泌炎癥物質，最終對免疫性疾病、膿毒癥達到治療目的[15]。本研究表明，膿毒癥組血清miR-23b水平低于對照組(P<0.05)，并隨著膿毒癥病情嚴重程度的加重而降低，且死亡組血清miR-23b水平低于存活組(P<0.05)。miR-23b具有減輕炎癥反應的作用，其水平升高會抑制細胞應激，促進炎癥細胞凋亡，并靶向調控轉化生長因子-β活性激酶，阻斷相關信號通路，從而降低膿毒癥炎癥因子水平，結果顯示，miR-23b通過降低炎癥細胞增殖、分化能力及增強炎癥細胞凋亡能力，從而使患者癥狀減輕，其可作為膿毒癥臨床診斷及預后判斷的指標[16-17]。

miR-146a通過與腫瘤壞死因子受體相關因子-6、白細胞介素-1受體相關激酶-1的作用，正性調節炎癥反應的信號通路，從而增強炎癥細胞遷移、侵襲能力，加快炎癥因子的分泌[18-19]。本研究顯示，膿毒癥組血清miR-146a水平較對照組升高(P<0.05)，并隨膿毒癥病情嚴重程度的加重而升高，且死亡組miR-146a水平高于存活組(P<0.05)。miR-146a通過刺激多種信號通路靶點，如CC類趨化因子5、Fas相關死亡域蛋白、白細胞介素-8等，加速免疫細胞凋亡，抑制免疫細胞分化過程，負反饋調控免疫反應，控制內毒素分泌，加速膿毒癥惡化，加重了機體的損害，結果顯示，miR-146a通過增強膿毒癥患者的炎癥反應而對機體產生作用，其具有較高的靈敏度和特異度，可作為早期判斷膿毒癥患者預后的指標，并為臨床治療膿毒癥提供指導[20-21]。

IDO是除肝臟外唯一存在的可催化L-色氨酸分子中吲哚環裂解并犬尿酸途徑降解的限速酶[22]。有研究表明，IDO利用色氨酸使T細胞增殖停止，分化受阻，并對T細胞產生毒性作用，抑制T細胞的活化，誘導其凋亡，降低活化T細胞的免疫功能，從而參與膿毒癥的病情發展[23]。本研究顯示，膿毒癥組IDO水平高于對照組(P<0.05)，并隨著膿毒癥病情嚴重程度的加重而升高，且死亡組IDO水平高于存活組(P<0.05)。由此可見，IDO通過影響膿毒癥患者機體免疫系統，從而加劇炎癥反應，其可作為膿毒癥預后判斷的相關因子，為膿毒癥患者轉歸提供理論參考。

Pearson相關分析結果顯示，miR-23b水平與miR-146a、IDO均呈線性負相關(r=-0.618、-0.623，P<0.001)，miR-146a水平與IDO呈線性正相關(r=0.552，P<0.001)；進一步采用ROC曲線分析結果顯示，miR-23b、miR-146a、IDO單獨檢測對膿毒癥的診斷均有一定的價值(AUC均大于0.700)，而且這3項指標聯合檢測診斷膿毒癥的價值更高。本研究尚存在不足，如雖然揭示了miR-23b、miR-146a、IDO緊密聯系，但未深入判斷三者相互反應機制，需要擴大樣本量，繼續對這3項指標進行研究。

綜上所述，膿毒癥患者血清miR-146a、IDO水平升高，miR-23b水平降低，這3項指標密切相關，可為膿毒癥的診斷、病情嚴重程度和預后判斷提供新的參考依據。