高危型HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測對宮頸高級別鱗狀上皮內病變的篩查價值*

侯書寧，程文國，陸紅梅，李瑩瑩，沈倩云，曹 月

揚州大學醫學院附屬醫院揚州市婦幼保健院檢驗科，江蘇揚州 225002

宮頸癌是指發生于宮頸鱗-柱狀上皮移行帶的女性惡性腫瘤。2018年WHO統計結果顯示：宮頸癌是全球女性第4大癌癥，發生率為13.1/10萬，2018年全球大約有57萬例宮頸癌患者，死亡病例約31.1萬例[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)是女性常見生殖道感染病原體，為一種黏膜微小共價雙鏈環狀DNA病毒，呈球形、無包膜，表面有72個殼微粒，主要由早期基因區(E區)、晚期基因區(L區)和長控制區(LCR)組成。HPV主要感染皮膚和黏膜組織的上皮細胞，與生殖器疣變、宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌發生密切相關，明顯的持續性感染可表現為單一型別感染、多型別感染。HPV檢測雖能檢測出是否有高危型HPV(HR-HPV)感染，但不能區分是短暫感染還是持續性感染。研究表明，HPV E6/E7 mRNA的轉錄表達是宮頸組織HPV持續感染和惡變所必需的，可作為反映宮頸病變進展的臨床標志物[2-3]。本研究通過比較分析HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)患者中的檢測結果，探討其在HSIL篩查中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選擇2020年6月至2021年7月在揚州市婦幼保健院因宮頸炎癥、接觸性出血等原因就診的疑似宮頸病變而轉陰道鏡活檢的639例患者作為研究對象，年齡16～73歲，平均(38.8±10.1)歲。按照年齡將患者分為≤25歲組、>25～35歲組、>35～45歲組、>45～55組、>55歲組。納入標準：患者均行HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測、液基薄層細胞學檢查(TCT)和宮頸活體組織檢查。排除標準：既往患有宮頸癌前病變患者；近期有激素使用史的患者。

1.2方法

1.2.1標本采集 在非月經期，統一由培訓合格的醫師采用宮頸刷采集研究對象宮頸脫落細胞，方法：取膀胱截石位，充分暴露宮頸，抹去分泌物，取樣器置于宮頸鱗柱狀交界處同一方向旋轉3～5圈，并停留6～8 s后連同刷子一起浸泡于2 mL保存液中送檢。

1.2.2TCT 采用三瑞集團液基薄層細胞制片機進行程序化處理，制成直徑約為2 cm的細胞涂片，使用95%乙醇固定，進行巴氏染色，然后鏡檢。宮頸細胞病理學診斷按照國際癌癥學會推薦的2001年Bethesda體系(TBS)分級：(1)未見CIN或惡性病變(NILM)；(2)不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)和不能明確意義的非典型腺上皮細胞(AGUS)；(3)低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)；(4)HSIL；(5)鱗狀細胞癌(SCC)和腺癌(AC)。細胞學陽性診斷是指ASCUS/AGUS及以上的病變。

1.2.3HR-HPV DNA分型(PCR-導流雜交法) 采用潮州凱普生物化學有限公司生產的37種HPV核酸檢測試劑盒，檢測試劑與對照系統靈敏度為99.5%，特異度為97.7%，可信區間下限均高于96%。按照試劑盒說明書進行操作，通過基因擴增技術和導流雜交技術，以核酸分子快速雜交儀為平臺通過反向雜交檢測擴增產物與包被有型特異性探針膜雜交結果，對37種HPV基因型進行分型檢測，其中包括14種HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)。整個實驗步驟包括：HPV DNA提取、PCR擴增、雜交、洗膜、顯色和結果判斷。檢測結果陽性點為清晰可見的藍紫色圓點，根據膜條上各型HPV探針排列，判斷陽性點為何種HPV類型。判斷標準：任何一種HR-HPV 亞型陽性即為陽性。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA檢測 采用分支鏈DNA信號擴增技術對標本中的14種HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)E6/E7 mRNA進行半定量檢測，試劑盒購自河南科蒂亞生物有限公司，檢測結果=RLU/cut-off(其中RLU為冷光儀讀數，cut-off=空白對照均值與空白對照標準差的3倍之和)，檢測結果值≥1.0為陽性。

1.2.5組織病理學檢查 活檢標本常規制成石蠟切片，HE染色，由病理科醫師閱片并做出病理診斷，以該診斷結果為金標準。組織病理學診斷：(1)慢性宮頸炎；(2)LSIL，包括CIN1；(3)HSIL，包括CIN2，CIN3和宮頸癌。

2 結 果

2.1HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較 對639例疑似宮頸病變患者分別進行HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測，HR-HPV DNA總陽性率為81.06%(518/639)，明顯高于HPV E6/E7 mRNA的52.58%(336/639)，差異有統計學意義(χ2=116.910，P<0.05)。

2.2不同年齡段患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較 不同年齡段患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽性率差異均無統計學意義(P>0.05)；相同年齡段患者HR-HPV DNA陽性率均高于HPV E6/E7 mRNA(P<0.05)。見表1。

表1 不同年齡段患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較[n(%)]

2.3不同細胞病理學分級患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較 不同細胞病理學分級患者比較，HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽性率差異均有統計學意義(P<0.05)；相同細胞病理學分級患者比較，NILM、ASCUS、LSIL患者的HR-HPV DNA陽性率均高于HPV E6/E7 mRNA陽性率(P<0.05)，而HSIL患者的HPV DNA陽性率與HPV E6/E7 mRNA陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同細胞病理學分級患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較[n(%)]

2.4不同組織病理學分級患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較 不同組織病理學分級患者比較，HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽性率均隨組織病理學分級增高而升高(P<0.05)；相同組織病理學分級患者比較，HR-HPV DNA陽性率均高于HPV E6/E7 mRNA陽性率(P<0.05)。見表3。

表3 不同組織病理學分級患者HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA檢測結果比較[n(%)]

2.5HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測篩查HSIL的價值 以組織病理學診斷結果為金標準，即HSIL為陽性，慢性炎癥及LSIL為陰性。HR-HPV DNA檢測篩查HSIL的靈敏度為97.14%，高于HPV E6/E7 mRNA的82.86%(χ2=3.968，P<0.05)；HR-HPV DNA檢測篩查HSIL的特異度為19.87%，低于HPV E6/E7 mRNA的49.17%(χ2=114.736，P<0.05)。見表4。

表4 HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA篩查HSIL的結果

2.6HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨和聯合檢測篩查HSIL的價值 以HSIL篩查結果為狀態變量(HSIL=1，慢性炎癥及LSIL=0)，以HR-HPV DNA二分類結果及HPV E6/E7 mRNA半定量結果為檢驗變量制作ROC曲線，結果顯示，HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨和聯合檢測篩查HSIL的曲線下面積(AUC)分別為0.587(95%CI：0.507～0.667)、0.755(95%CI：0.671～0.838)、0.770(95%CI：0.693～0.847)，二者聯合檢測及HPV E6/E7 mRNA單獨檢測篩查HSIL的AUC大于HR-HPV DNA單獨檢測的AUC(Z=5.102、3.964，P<0.05)。見圖1。

圖1 HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨和聯合檢測篩查HSIL的ROC曲線

3 討 論

目前宮頸癌常用的篩查方法為HPV DNA檢測和TCT。TCT的受影響因素較多，通常與病理診斷醫師的經驗有關，容易漏檢。宮頸癌細胞發生形態異常通常為晚期，限制了TCT對宮頸癌的早期診斷[4]。也有研究報道，TCT與傳統巴氏涂片法相比，其診斷HSIL的靈敏度和特異度均無明顯優勢[5]。HPV檢測相對于細胞學檢查有較高的靈敏度和可重復性，是篩查宮頸癌和癌前病變的重要手段[6-7]。2010年歐洲生殖道感染和腫瘤研究組織(EUROGIN)推薦HPV DNA檢測可用于宮頸癌的初步篩查。國內研究表明，采用二代雜交捕獲技術檢測HPV DNA可作為宮頸癌篩查的初步手段。HPV DNA檢測只能說明患者有無感染HPV，并不能說明病毒有無整合入宿主細胞而引發持續性感染。HR-HPV持續感染是導致癌前病變和宮頸癌的重要致病因素[8-9]。HR-HPV感染后，DNA基因整合到宿主細胞染色體中，E6/E7表達的癌基因蛋白有抑制抑癌蛋白p53和Rb功能，影響感染細胞的生長周期，導致細胞向癌變方向發展[10-11]。HPV E6/E7 mRNA檢測可反映HPV致癌基因E6/E7活動度，判斷病毒基因是否整合到宿主基因組中以及區分HPV狀態，在早期宮頸癌篩查中具有重要意義。REN等[12]研究表明HPV E6/E7 mRNA定量分析是ASCUS分流的一種有價值的檢測方法。

本研究發現，隨著細胞病理學級別升高，HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽性率也升高，且HR-HPV DNA總體陽性率明顯高于HPV E6/E7 mRNA(P<0.05)，表明部分HPV感染未引起宿主細胞的病理性變化。在組織病理學檢查結果中HPV E6/E7 mRNA陽性率低于HR-HPV DNA陽性率(P<0.05)，這與BARON等[13]的研究結果一致，這可能是由于大多數HPV感染是一過性感染，病毒基因未整合到宿主基因中或者整合程度低，HPV E6/E7 mRNA檢測呈陰性，表示宮頸細胞無惡變轉化風險或者處于靜止期，但HPV DNA檢測仍可以檢測到HPV的存在。HPV E6/E7 mRNA檢測可以降低一過性HPV感染出現的假陽性，提高病理診斷符合率。

本研究顯示，HPV E6/E7 mRNA檢測篩查HSIL的AUC大于HR-HPV DNA(P<0.05)，表明HPV E6/E7 mRNA較HR-HPV DNA篩查HSIL的效能更高，篩查宮頸癌前病變的效果更好。由于HPV E6/E7 mRNA只表達于感染活躍的細胞，且其負荷量與疾病進展有關，故推測HPV E6/E7 mRNA對于HSIL的檢測更為特異，對宮頸病變的發生、發展有很好的預測意義，是臨床診療中更高效、可靠的篩查方法。BRUNO等[14]研究表明，在3年的隨訪中，HPV E6/E7 mRNA檢測陽性的患者宮頸病變惡性發展的風險更高。

本研究可能存在一定局限性，需積累更多樣本進一步驗證HPV DNA和HPV E6/E7mRNA對HSIL的診斷效能；還應避免因樣本容量不足，導致檢驗效能降低，出現假陰性結果，影響診斷試驗評價結果的真實性。

目前我國針對宮頸癌遵循“三階梯”診斷程序進行臨床診斷，即宮頸細胞病理學檢查和HR-HPV檢測、陰道鏡檢查及組織病理學檢查[15]，細胞病理學檢查陽性合并HR-HPV DNA陽性患者轉診陰道鏡檢查及組織病理學診斷。因此，提高“三階梯”篩查模式中第一階段的靈敏度和特異度對提升整個宮頸癌早期篩查質量至關重要。HPV E6/E7 mRNA的特異度相對較高，其與HR-HPV DNA聯合檢測對HSIL具有較高的篩查價值，可降低因較高HR-HPV DNA陽性率的細胞學輕度異常患者的陰道鏡轉診率，為宮頸鱗狀上皮癌前病變的分流提供相關證據。

綜上所述，HR-HPV DNA檢測篩查HSIL的靈敏度比HPV E6/E7 mRNA高，但特異度較低，而HPV E6/E7 mRNA檢測對HSIL的臨床篩查價值高于HR-HPV DNA，可為宮頸癌前病變分流提供依據。