乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達水平與老年乳腺癌患者改良根治術預后的關系*

朱 偉，楊 霜，崔立娟，張肖玲，楊 凱

江蘇省張家港市中醫醫院病理科，江蘇蘇州 215600

改良根治術是目前乳腺癌治療最常用術式，不僅可解除腫瘤占位效應，延長患者生存期限，還可保留胸肌，術后外觀較好[1]。但文獻指出，改良根治術后2～3年內仍有10%～30%的乳腺癌患者可能會出現局部復發、遠處轉移的情況，繼而增加患者預后不良風險[2]。同時，由于老年乳腺癌患者多合并基礎疾病，機體免疫力低下，預后不良風險更高[3]。因此，明確老年乳腺癌患者改良根治術預后情況及可能與預后相關的指標，對指導乳腺癌早期干預尤為重要。目前，臨床多采用影像學手段明確乳腺癌復發、轉移情況，以評估患者預后，雖可觀察病灶變化，但所獲結果僅為當下表現，無法定量分析腫瘤復發、轉移風險，應用存在局限[4]。腫瘤轉移抑制基因-1(KiSS-1)是一種新發現的抑癌基因，報道指出，KiSS-1與乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤密切相關，該基因表達缺失可能會增加腫瘤轉移風險[5]。基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)作為MMP家族重要成員，不僅可降解細胞外基質，促進腫瘤細胞生長，而且可誘導腫瘤細胞免疫耐受[6]。結合KiSS-1、MMP-2作用機制，二者可能與老年乳腺癌患者改良根治術預后有關，但具體關系尚未明確。鑒于此，本研究著重分析乳腺癌組織中KiSS-1、MMP-2表達水平與老年乳腺癌患者改良根治術預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2012年3月至2017年3月在本院接受改良根治術治療且完成1年隨訪的女性老年乳腺癌患者資料。設計基線資料填寫表，閱讀患者相關基線資料并記錄研究所需資料，包括：年齡、體質量指數(BMI)、合并基礎疾病(高血壓，收縮壓≥140 mm Hg，舒張壓≥90 mm Hg；糖尿病，空腹血糖≥7.0 mmol/L，和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L)、美國紐約麻醉醫師協會(ASA)分級[8](Ⅰ～Ⅲ級)、腫瘤最大徑、病理類型(浸潤癌、非浸潤癌)、TNM分期[9](Ⅰ～Ⅱ期)、區域淋巴結轉移(影像學檢查可見同側Ⅰ、Ⅱ水平腋窩淋巴結轉移，或同側內乳淋巴結轉移等)。納入標準：(1)乳腺癌診斷符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2015版)》[7]中相關診斷標準，且經手術病理檢查確診；(2)年齡≥60歲；(3)單側乳腺癌；(4)具有改良根治術手術指征(TNM分期于Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌，腫瘤未累及胸肌筋膜)，且首次接受改良根治術治療；(5)病理組織切片保存完整；(6)全部患者病歷資料、相關檢查資料及隨訪資料等均完整。排除標準：(1)合并胃癌、宮頸癌等其他惡性腫瘤患者；(2)合并先天性心臟病、肝腎衰竭等重要臟器病變患者；(3)合并感染性肺炎患者；(4)合并免疫系統疾病或凝血功能異常患者；(5)腫瘤遠處轉移患者；(6)術前接受放化療、免疫抑制劑等相關治療患者。根據納入和排除標準進行篩選，最終納入115例患者作為研究對象。納入患者年齡63～75歲，平均(68.52±1.71)歲；BMI 17.5～24.8 kg/m2，平均(21.03±1.04)kg/m2；病理類型：浸潤癌78例，非浸潤癌37例。

1.2儀器與試劑 熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)分析儀(型號：lepgen-96)購自濟南歐萊博電子商務有限公司；低速離心機(型號：TD5K)購自上海舜制儀器有限公司；Trizol試劑盒均購自上海通蔚生物有限公司；2×Mic、DNA Ladder試劑均購自上海時代生物科技有限公司；CEA試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1預后評估及分組 改良根治術后患者均接受1年隨訪，隨訪期間間隔3個月復查1次CT或MRI，若檢查結果正常，則間隔6個月復查1次。統計患者隨訪1年期間病死、腫瘤復發(CT或MRI檢查可見原病灶切除部位出現新病灶)、遠處轉移(CT或MRI檢查可見縱隔淋巴結轉移、胸壁轉移、肺轉移等)情況，將病死、腫瘤復發、腫瘤遠處轉移患者納入預后不良組，其他則納入預后良好組。

1.3.2血清癌胚抗原(CEA)水平檢測 采集患者術前空腹外周靜脈血5 mL，以離心半徑10 cm、轉速4 000 r/min離心10 min，收集上層血清，采用電化學發光法及相應試劑盒檢測CEA，檢驗流程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3乳腺癌組織中KiSS-1、MMP-2表達水平檢測 取乳腺癌標本組織(約100 mg)，置于液氮浴中研碎，添加1 mL Trizol裂解液，并采用Trizol試劑盒提取標本總RNA，然后進行反轉錄反應；反轉錄反應體系為共20 μL，包括標本RNA 1.5 μL、Rever Tra Ace 1 μL、Rnase抑制劑1 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、Rnase Free H2O 9.5 μL、Random Peimer 1 μL、5×RT緩沖液4 μL，然后依次置于30 ℃環境下孵育10 min、42 ℃環境下反轉錄反應20 min、99 ℃環境下滅活5 min，最后于4 ℃環境下，用低速離心機以1 200 r/min轉速離心10 min，離心半徑為6 cm，提取標本cDNA；取標本進行PCR擴增，擴增上游引物序列為5′-TAGAATCCCTGGGCCTCCTG-3′，下游引物序列為5′-TCCCTTGGTGCCGTCTTC-3′。反應條件：94 ℃環境下反應2 min、94 ℃環境下反應45 s、60 ℃環境下反應30 s、72 ℃環境下反應30 s，設定40個循環，最后在72 ℃環境下延伸7 min，反應結束用2-ΔΔCt法分析KiSS-1、MMP-2表達水平。

2 結 果

2.1老年乳腺癌患者改良根治術預后情況 115例老年乳腺癌患者隨訪1年內預后不良26例，占22.61%(26/115)，其中病死5例，復發13例，遠處轉移8例。

2.2老年乳腺癌改良根治術不同預后患者基線資料比較 預后不良組和預后良好組年齡、BMI、合并基礎疾病、ASA分級、腫瘤最大徑、病理類型、TNM分期、區域淋巴結轉移比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 老年乳腺癌改良根治術不同預后患者基線資料比較

2.3老年乳腺癌改良根治術不同預后患者血清CEA水平及乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達水平比較 預后不良組血清CEA水平、乳腺癌組織MMP-2表達水平高于預后良好組，乳腺癌組織KiSS-1表達水平低于預后良好組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同預后老年乳腺癌患者血清CEA水平及乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達水平比較[M(P25,P75)]

2.4乳腺癌組織KiSS-1表達水平與MMP-2的相關性分析 經一般線性雙變量Spearman直線相關檢驗，乳腺癌組織KiSS-1表達水平與MMP-2呈負相關(r=-0.327，P<0.05)，見圖1。

2.5老年乳腺癌患者改良根治術預后不良的影響因素分析 以不同預后老年乳腺癌患者中差異有統計學意義的指標CEA、KiSS-1、MMP-2作為自變量(均為連續變量)，老年乳腺癌患者改良根治術預后情況(1=預后不良，0=預后良好)作為因變量建立Logistic回歸模型，分析結果顯示，血清CEA、乳腺癌組織中KiSS-1、MMP-2異常表達與改良根治術預后有關，KiSS-1高表達可能是老年乳腺癌患者改良根治術預后不良的保護因素(OR=0.271，P<0.05)，CEA、CEAMMP-2高表達可能是老年乳腺癌患者改良根治術預后不良的獨立危險因素(OR=3.619、16.436，P<0.05)，見表3。

表3 老年乳腺癌患者改良根治術預后不良的影響因素分析

2.6KiSS-1、MMP-2單獨和聯合檢測對老年乳腺癌患者改良根治術預后不良的預測價值 以乳腺癌組織中KiSS-1、MMP-2表達作為檢驗變量，老年乳腺癌患者改良根治術預后情況作為狀態變量(1=預后不良，0=預后良好)繪制ROC曲線，結果顯示，KiSS-1、MMP-2單獨和聯合檢測預測老年乳腺癌患者改良根治術預后不良的AUC分別為0.898、0.820、0.939，均>0.800，均有一定預測價值，當二者的cut-off值分別為5.825、2.015時，預測價值最佳。見圖2、表4。

3 討 論

乳腺癌作為女性常見惡性腫瘤，發病率約為24.2%，且流行病學調查顯示，近年來乳腺癌發病率逐年升高[10]。目前，臨床治療乳腺癌多采用改良根治術以切除腫瘤病灶，遏制疾病進展，但術后仍可能會出現腫瘤復發、轉移情況，導致患者預后不良[11]。

CEA是乳腺癌診斷和預后評估常用的血清標志物，主要由內胚層細胞分泌而來，血清水平升高提示腫瘤復發、轉移高風險[12]。但有報道指出，血清CEA水平評估乳腺癌預后特異度不佳，且容易受到炎癥影響，應用存在局限[13]。因此，需尋求其他評估老年乳腺癌患者改良根治術預后的新型指標。本研究比較了老年乳腺癌改良根治術不同預后患者的基線資料、血清CEA水平及乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達水平，發現老年乳腺癌改良根治術預后不良組乳腺癌組織MMP-2表達水平高于預后良好組(P<0.05)，乳腺癌組織KiSS-1表達水平低于預后良好組(P<0.05)，推測KiSS-1、MMP-2也可用于老年乳腺癌患者改良根治術預后的評估。

KiSS-1作為一種腫瘤轉移抑制基因，最早由黑色素瘤細胞株分離而來，近年來研究發現，發生轉移的腫瘤組織中KiSS-1表達缺失[14]。據報道，KiSS-1基因編碼殘基肽可結合G蛋白偶聯受體54(GPR54)，促進磷脂酰肌醇二磷酸水解及鈣離子活動，且可加速花生四烯酸釋放、絲裂原活化蛋白激酶p38磷酸化，從而抑制腫瘤細胞增殖[15]。此外，KiSS-1基因編碼殘基肽結合GPR54還可激活磷脂酶C，促使細胞內鈣離子排出，從而抑制腫瘤細胞的復制、侵襲能力[16]。MMP是機體重要降解酶，它不僅具有降解細胞外基質作用，還可調控生長因子表達，參與腫瘤的發生、發展過程[17]。MMP-2是MMP家族中參與降解細胞外基質的關鍵酶，MMP-2被激活后可轉變為Ⅳ型膠原酶，從而發揮破壞細胞外基質屏障，促進細胞增殖的作用[18]。據報道，在乳腺癌發展過程中，MMP-2可利用降解基質原理增強腫瘤細胞轉移能力，且可為血管內皮細胞增殖、新血管生成提供有利條件[19]。參考上述研究結果，結合KiSS-1、MMP-2的作用機制，推測二者可能與老年乳腺癌患者改良根治術預后有關。

本研究Logistic回歸模型分析結果顯示，KiSS-1高表達可能是老年乳腺癌患者改良根治術預后不良的保護因素(OR=0.271，P<0.05)，而MMP-2高表達可能是老年乳腺癌患者改良根治術預后不良的獨立危險因素(OR=16.436，P<0.05)，證實了老年乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2異常表達與改良根治術預后有關。推測其可能原因：乳腺癌組織中KiSS-1表達降低會減少氨基酸殘基肽(轉移抑素)生成，而氨基酸殘基肽可抑制腫瘤細胞增殖分化、誘導腫瘤細胞凋亡，因此KiSS-1低表達可能會降低其抑制腫瘤細胞轉移、復發的作用，導致乳腺癌患者改良根治術預后不良[20]；乳腺癌組織中MMP-2表達增加則會破壞腫瘤細胞屏障與基底膜，加速腫瘤新血管生成，從而促使腫瘤細胞復發、轉移，影響患者改良根治術預后[21]。ROC曲線分析結果發現，乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2預測老年乳腺癌患者改良根治術預后不良風險均有理想的價值，當二者的的cut-off值分別為5.825、2.015時，可獲得最佳預測效果，而且隨著KiSS-1表達降低、MMP-2表達增加，患者預后不良風險增加。本研究結果提示，對于術前乳腺癌組織中KiSS-1低表達、MMP-2高表達的老年乳腺癌患者，改良根治術后臨床應根據患者實際情況合理選擇放化療輔助干預，以抑制腫瘤細胞復發與轉移，改善患者預后。而KiSS-1、MMP-2聯合檢測預測老年乳腺癌改良根治術預后不良的AUC高于單獨檢測，臨床可考慮將二者聯合觀察，使患者整體獲益。同時，本研究還發現，老年乳腺癌組織KiSS-1表達水平與MMP-2呈負相關(r=-0.327，P<0.05)，這一結果可能與KiSS-1能夠阻斷MMP通路有關，但具體影響機制未來仍需探討。此外，本研究雖經Logistic回歸模型分析證實CEA異常表達與老年乳腺癌改良根治術預后有關，但因其存在一定局限，因此未分析其對老年乳腺癌改良根治術預后不良的預測價值，且研究僅統計乳腺癌患者隨訪1年內預后情況，研究存有局限，未來仍需延長隨訪時間、展開前瞻性研究加以驗證。

綜上所述，乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達水平與改良根治術預后不良有關，考慮未來可檢測老年乳腺癌患者術前KiSS-1、MMP-2表達水平，為老年乳腺癌患者改良根治術預后評估提供輔助。