外排泵在肺炎克雷伯菌對左氧氟沙星耐藥中的作用*

江培濤，吳 鈞，方 敏，馬 超，李琛澤

1.南京鼓樓醫院集團儀征醫院/揚州大學醫學院附屬醫院檢驗科，江蘇揚州 211900；2.南京醫科大學附屬腦科醫院檢驗科，江蘇南京 210029

肺炎克雷伯菌(KP)是臨床常見的革蘭陰性條件致病菌，可以引起呼吸道、尿道、血流等多種感染性疾病。除頭孢菌素等β-內酰胺類抗菌藥物之外，左氧氟沙星(LVX)等氟喹諾酮類抗菌藥物因為具有口服吸收好、生物利用度高、不良反應少等優點，也常常作為成年人KP感染的治療選擇。但是，近年來KP引起的醫院感染及其耐藥率逐年增高，尤其是以耐碳青霉烯類藥物為代表的多重耐藥KP感染的不斷增加，常常導致抗菌治療失敗、住院時間延長、治療費用增加，甚至病死率增高等不良后果，因而如何治療多重耐藥KP感染逐漸成為臨床醫師面臨的難題。外排泵系統的高度表達是KP獲得多重耐藥的機制之一，其中屬于耐藥結節分化(RND)家族的AcrAB-TolC外排泵在腸桿菌科中檢出率最高[1]。由外排泵介導的KP對碳青霉烯類、替加環素等抗菌藥物的耐藥機制研究已屢見不鮮，而外排泵介導KP對喹諾酮類耐藥機制報道相對較少。本研究擬探討外排泵OqxAB、AcrAB和QepA在KP臨床菌株中的基因表達情況及其在KP對LVX耐藥中的作用，以期為臨床預防和控制多重耐藥KP感染提供更多理論參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 106株KP分離自江蘇省儀征市南京鼓樓醫院集團儀征醫院2018年7月至2020年12月的門診和住院患者，已剔除同一患者相同部位的重復分離株。標本來源：重癥監護病房24株，呼吸內科31株，神經外科20株，胸外科13株，兒科6株，其他科室12株；標本類型：痰及肺泡灌洗液74株，尿液18株，膿液及傷口分泌物7株，血液4株，導管3株。質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC 25922、KP ATCC 700603，均購自生物梅里埃公司。

1.2主要儀器與試劑 GHP-9270數顯隔水式恒溫孵育箱(上海精宏醫療器械廠)；MicroScan WalkAway 96 Plus 細菌鑒定藥敏分析儀(美國貝克曼公司)；TGL-18R冷凍高速離心機(珠海Hema醫學儀器公司)；NanoDrop2000分光光度計(美國Thermo公司)；ABI7500PCR儀(美國ABI公司)；LVX注射液(浙江醫藥股份有限公司)；LB肉湯(杭州百思生物技術公司)；水解酪蛋白(MH)瓊脂(杭州濱河生物技術公司)；細菌基因組實時定量反轉錄PCR(qRT-PCR)試劑盒(北京天根生化科技公司)；瓊脂糖(廣州賽國生物科技公司)。

1.3菌株鑒定和藥物敏感試驗(簡稱藥敏試驗) 所有菌株的分離培養均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》第4版操作，菌種鑒定和LVX等常規藥敏試驗(微量肉湯稀釋法)均由MicroScan WalkAway 96 Plus系統完成。所有菌株的鑒定均通過PCR檢測rpoB基因進行確認。藥敏試驗判斷標準參照2018版臨床實驗室標準化協會(CLSI)M100[2]執行，以LVX的最低抑菌濃度(MIC)≤2.00 μg/mL為敏感，MIC=4.00 μg/mL為中介，MIC≥8.00 μg/mL為耐藥。隨機選取24株對LVX耐藥的KP作為試驗組，另隨機選取27株對LVX非耐藥的KP(25株敏感，2株中介)作為對照組進行后續試驗。

1.4KP的外排泵表型測定 參照文獻[3-4]以KP ATCC700603標準株生長良好的羰基氰氯苯腙(CCCP)溶液水平25 μg/mL為外排泵抑制劑工作水平；采用微量肉湯稀釋法分別測定加入CCCP前后LVX對兩組KP的MIC，同時以不含藥物的肉湯作為生長對照。本試驗以加入外排泵抑制劑后LVX的MIC值降低至原值的1/4或更低作為外排泵表型陽性的判定標準。

1.5外排泵基因檢測 采用qRT-PCR檢測外排泵OqxAB、AcrAB和QepA相應表達基因OqxA、acrB和QepA的表達水平。用陽離子調節的MH肉湯稀釋的隔夜細菌培養物在35 ℃下生長至對數階段，搖動混勻(200 r/min)。在無RNase的環境中，用Trizol法從分離物中提取總RNA。測定RNA的產量和質量，然后將RNA水平調整到150 ng/mL。使用反轉錄試劑盒將所有分離物的總RNA反轉錄成cDNA；然后用qRT-PCR(60 ℃ 30 s；50 ℃ 5 min；95 ℃ 10 min；40次循環95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min；60 ℃ 30 s)對靶基因的相對表達量進行測定。以KP ATCC700603作為參考菌株(表達水平=1)，用2-ΔΔCt方法根據管家基因rrsE(KP)的表達計算被測基因的相對表達量，所有標本3復孔測定，取平均值。用于上述基因檢測的引物(表1)合成及上述試驗由南京祖和生物技術公司完成。

1.6acrR基因突變檢測 對LVX耐藥KP臨床分離株，用表1所述引物進行PCR并測序，以證實acrR中相對于參考KP株MGH78578(CP000647)[5]的突變存在。

表1 相關基因引物序列和產物長度

1.7統計學處理 用Whonet5.6軟件進行抗菌藥物敏感性統計；用SPSS20.0軟件通過t檢驗分析兩組之間基因表達水平的差異；用線性回歸分析MIC與基因表達水平之間的關系；采用χ2或Fisher確切概率法分析兩組之間外排泵表型的差異。以P<0.05(雙側)為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1藥敏試驗及菌株確認試驗結果 106株KP對LVX的敏感率為69.8%(74/106)，中介率為3.8%(4/106)，耐藥率為26.4%(28/106)，見表2。rpoB基因PCR電泳結果顯示，隨機選取的51株菌株均為KP，見圖1。

表2 106株KP對常用抗菌藥物的藥敏試驗結果[%(n)]

注：試驗組01～24分別對應菌株號為LVX-R2、LVX-R7、LVX-R11、LVX-R15、LVX-R26、LVX-R32、LVX-R39、LVX-R42、LVX-R53、LVX-R67、LVX-R69、LVX-R71、LVX-R72、LVX-R74、LVX-R77、LVX-R79、LVX-R89、LVX-R94、LVX-R96、LVX-R97、LVX-R100、LVX-R106、LVX-R108、LVX-R111的KP；對照組01～27分別對應菌株號為LVX-S66、LVX-S68、LVX-S70、LVX-S75、LVX-S76、LVX-S78、LVX-S80、LVX-S81、LVX-S82、LVX-S83、LVX-S84、LVX-S85、LVX-S86、LVX-S87、LVX-S88、LVX-S90、LVX-S91、LVX-S92、LVX-S93、LVX-S95、LVX-S98、LVX-S99、LVX-S101、LVX-S102、LVX-S113、LVX-S62、LVX-S103的KP。M為DNA Marker，條帶大小從上至下依次為1 000、700、500、400、300、200、100 bp。

2.2外排泵表型試驗結果 隨機選擇的51株KP中，9株外排泵表型試驗結果為陽性(17.6%)。參照CLSI M100(S28)標準，試驗組中有3株KP表現為外排泵表型試驗陽性，其中2株對LVX耐藥逆轉為敏感；對照組中有6株KP表現為外排泵表型試驗陽性，其中2株對LVX中介的菌株均表現為外排泵表型試驗陽性，且均逆轉為敏感，25株對LVX敏感的菌株中有4株表現為外排泵表型試驗陽性。試驗組、對照組外排泵表型試驗結果差異無統計學意義(χ2=0.293,P>0.05)。見表3。

表3 兩組KP臨床分離株外排泵表型試驗結果

2.3qRT-PCR結果 兩組KP外排泵基因OqxA、QepA表達水平差異無統計學意義(t=0.651、-0.669，P=0.518、0.506，圖2A、2B)，而acrB表達水平差異有統計學意義(t=12.76，P<0.001，圖2C)，且試驗組acrB表達水平與LVX的log2MIC呈正相關(r=0.544，P=0.006，圖2D)。

注：A、B、C分別為兩組KP外排泵基因OqxA、QepA、acrB表達水平比較；D為外排泵基因acrB表達水平與log2 MIC間關系散點圖。。

2.4acrR基因突變檢測 試驗組acrR基因PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳及測序結果顯示菌株02(LVX-R7)、03(LVX-R11)、05(LVX-R26)、07(LVX-R39)、11(LVX-R69)、12(LVX-R71)、18(LVX-R94)、21(LVX-R100)、23(LVX-R108)、24(LVX-R111)擴增出969 bp大小(野生型)的目的片段，而其余14株(58.3%)均擴增出2 000 bp大小(突變型)的條帶(圖3)。經測序比對，兩種產物與美國生物信息中心基因庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中KP株MGH78578序列一致性達到98%以上。突變型菌株序列改變主要為堿基置換(圖4、5)。10株攜帶野生型acrR基因的菌株與14株攜帶突變型acrR基因的菌株acrB基因表達水平差異無統計學意義(t′=0.993，P=0.347)。

注：01～24分別對應試驗組菌株號為LVX-R2、LVX-R7、LVX-R11、LVX-R15、LVX-R26、LVX-R32、LVX-R39、LVX-R42、LVX-R53、LVX-R67、LVX-R69、LVX-R71、LVX-R72、LVX-R74、LVX-R77、LVX-R79、LVX-R89、LVX-R94、LVX-R96、LVX-R97、LVX-R100、LVX-R106、LVX-R108、LVX-R111的KP；M為DNA Marker。

圖4 試驗組部分突變型菌株acrR基因正向測序峰圖

圖5 試驗組部分突變型菌株acrR基因堿基序列比對圖

3 討 論

KP是臨床常見的條件致病菌，2019年CHINET三級醫院數據表明，其在臨床標本中的檢出率為15.17%，僅次于大腸埃希氏菌，且該菌對碳青霉烯類的耐藥率呈持續上升趨勢，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%、2.9%上升至2019年的25.3%、26.8%，對環丙沙星耐藥率從2005年的41.0%逐年下降至2014年的22.4%后又回升至2019年的38.1%，對LVX的耐藥率從2017年的26.6%上升至2019年的33.4%[10]。本研究中106株KP對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為23.6%和25.5%，對環丙沙星和LVX的耐藥率為分別為27.4%和26.4%，均低于全國水平。分析差異產生的原因，可能與南京鼓樓醫院集團儀征醫院收治病種及抗菌藥物可選種類與三級醫院不同有關，后者收治患者病情相對復雜，醫院獲得性感染及多重耐藥菌感染常見，抗菌藥物選擇壓力大，導致多種抗菌藥物的耐藥率較高。

LVX屬于第3代喹諾酮類抗菌藥物，一般用于治療成人呼吸道、泌尿生殖道和皮膚軟組織等感染，該藥具有廣譜抗菌作用，對多數腸桿菌目細菌、革蘭陽性菌、肺炎支原體和衣原體有抗菌作用。本研究表明LVX體外抗菌活性強于第2代喹諾酮類抗菌藥物環丙沙星，這與全國數據一致[10]。LVX主要作用機制是通過抑制細菌DNA解旋酶的活性，阻止細菌DNA的合成而導致菌體死亡。

研究表明，KP對氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機制除了DNA解旋酶和拓撲異構酶突變之外，質粒介導耐藥、外膜通透性下降以及外排泵因素都有作用[1,11-12]。AcrAB-TolC外排泵系統廣泛分布于革蘭陰性菌中，屬于RND超家族，以質子驅動力為能量，通過外排泵將進入菌體內的藥物或對自身有害的物質排出體外[1]。同時文獻[4,13]報道，KP AcrAB-TolC外排泵可能與其毒力有關，該外排泵主要由膜融合蛋白(AcrA)、外排轉運蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)3部分組成。有關外排泵介導KP耐藥多見于KP對碳青霉烯類、替加環素等限制使用級抗菌藥物耐藥的報道中[8,13-14]，但有關外排泵介導KP對LVX耐藥性與外排轉運蛋白相關基因表達水平和調節因子變異之間關系的研究尚不多見。本研究顯示，對LVX耐藥的24株KP(試驗組)中，有3株表現為外排泵表型試驗陽性，其中2株對LVX耐藥逆轉為敏感；對LVX非耐藥的27株KP(對照組)中，6株表現為外排泵表型試驗陽性，其中2株對LVX耐藥逆轉為敏感，但兩組的外排泵表型試驗結果差異無統計學意義(P>0.05)，這說明外排泵可能廣泛流行于KP中，但本研究樣本量小，其真實差異有待進一步研究。值得一提的是，本研究是一項回顧性分析，2019年CLSI將腸桿菌目LVX的敏感性折點修訂至MIC≤0.5 μg/mL，若以此為標準則外排泵表型陽性菌株均集中在對LVX耐藥和中介的菌株中，且中介菌株全部表現為外排泵表型陽性并可逆轉為對LVX敏感。該結果說明外排泵在KP對LVX的耐藥機制中起到一定作用。本研究進一步分析了KP 3種外排泵轉運蛋白相關基因OqxA、QepA和acrB表達水平與LVX MIC的關系，結果顯示OqxA、QepA表達水平與MIC的升高并無相關性，這與文獻[8]報道相近。但試驗組與對照組的acrB表達水平差異有統計學意義(t=12.76，P<0.001)，且acrB表達水平與LVX的log2MIC呈正相關(r=0.544，P=0.006)，說明AcrAB外排系統可能是介導KP耐藥的一個重要機制。需要指出的是，本研究中OqxA在對LVX敏感的KP中的表達水平高于對LVX耐藥的KP，這與翟俊斌[15]等關于對碳青霉烯類耐藥的KP的研究一致。類似的研究結果表明OqxAB外排系統雖廣泛分布于KP中，但并不是介導KP對LVX、碳青霉烯類等抗菌藥物耐藥的機制，這與以往的報道不同[16-17]，其機制和原因有待深入研究。

研究表明，AcrAB-TolC外排泵的調控體系中，整體調控因子MarA和RamA增加該泵的外排作用，局部調控因子acrR阻遏AcrAB的外排作用[18]。據此推斷acrR的低表達或突變導致的外排阻遏功能缺失將會導致細菌耐藥性增高，本研究分析了對LVX耐藥的KP的局部調控因子acrR的突變現象，在24株耐藥的KP中，有14株(58.3%)發生了acrR基因突變，突變的主要類型為堿基置換。但攜帶突變型acrR基因的KP(14株)的acrB基因表達水平并不顯著高于攜帶野生型acrR基因的KP(10株)。因而推測acrR因子的阻遏調節在AcrAB-TolC外排泵介導的KP對LVX耐藥中不占主導作用，在10株含野生型acrR基因的對LVX耐藥的KP中，其他機制可能共同介導了該菌對LVX的耐藥。本研究尚存在一定局限性，如樣本量較小，還需積累樣本量，對OqxA在對LVX敏感KP中的表達水平高于對LVX耐藥KP的機制進一步研究。

綜上所述，外排泵OqxAB、AcrAB和QepA雖然廣泛流行于革蘭陰性菌中，尤其是OqxAB在KP中廣泛表達，但介導KP對LVX耐藥的主要外排系統是AcrAB。