不同林齡頂壇花椒林地土壤微生物濃度與生物量化學計量特征

喻陽華，吳銀菇，宋燕平，李一彤

1.貴州師范大學喀斯特研究院/國家喀斯特石漠化防治工程技術研究中心，貴州 貴陽 550001；2.貴州師范大學地理與環境科學學院，貴州 貴陽 550025

中國西南喀斯特區受亞熱帶季風氣候和人為活動影響，造成土壤侵蝕嚴重、土壤生產力降低，導致石漠化發育，生態修復成為必然趨勢（Wang et al.，2004；萬軍，003）。頂壇花椒（Zanthoxylum planispinumvar.dintanensis）為竹葉椒（Zanthoxylum planispinum）的一個變種，喜鈣、耐旱，水土保持性能較好，在石漠化治理和生態系統恢復過程中價值突出。貞豐-關嶺花江片區自1992年起大規模種植頂壇花椒，形成了獨具特色的人工林，在土壤生態系統修復和山區生態治理中發揮了顯著作用（龍健等，2012）。但隨生長年限增加，出現了掛果期與輪伐周期縮短、產量下降，以及土壤養分貧瘠和質量退化等問題。

土壤微生物是土壤的重要組成部分，成為連接土壤與植物的橋梁（Devi et al.，2006；Leff et al.，2015），其生物量（SMB）能夠指示生態系統功能的變化，被用來評價土壤質量和反映微生物群落狀態的變化（He et al.，2003）。生態化學計量學是研究生態系統能量與多重化學元素平衡的科學，是探索不同生態系統組成之間相互聯系與內在機制的重要方法，被廣泛應用于微生物驅動生態過程的研究（Buchkowski et al.，2015；Zhu et al.，2021）。土壤微生物化學計量較元素化學計量能更好地表征土壤養分需求程度和資源利用策略，指示植物N、P供給的限制狀況（Cleveland et al.，2007；李萬年等，2020）。林齡能夠改變物種組成、群落結構和林內小氣候生境（Zhong et al.，2020），由林齡引起的林分和土壤環境變化能夠間接影響土壤微生物參與養分循環（楊凱等，2009；范媛媛等，2019）。相關研究表明，同種植物不同林齡的土壤微生物群落、SMB具有差異（Adair et al.，2013；Zhu et al.，2021）；牛小云等（2015）研究顯示，土壤微生物群落隨落葉松（Larixkaempferi）林齡增加呈降低趨勢；Zhang et al.（2018）研究發現，隨油松（Pinustabulaeformis）林齡增加土壤 SMB逐漸升高；而Taylor et al.（2007）研究表明，隨紅云杉（Picea rubens）林齡增加SMB變化不顯著，導致該結果的原因與林分類型、林齡跨度和環境條件有關。目前關于林齡與土壤微生物化學計量關系的研究多集中在森林演替、植被恢復和不同林型等方面（Xiao et al.，2021；劉寶等，2019；胡宗達等，2021），對同種植物不同林齡土壤微生物化學計量特征研究較少，土壤性質與微生物化學計量的關聯尚不明確。因此，本文研究土壤微生物化學計量隨林齡的變化特征，探明土壤微生物化學計量間的互作效應，以及對土壤因子的響應，有利于剖析土壤微生物化學計量與林齡的內在關系，以期為頂壇花椒人工林土壤質量評價、可持續經營管理等提供科學支撐。

基于此，以 5—7、10—12、20—22、28—32 a頂壇花椒人工林的表層土壤（0—20 cm）為對象，測定土壤微生物濃度、SMB，旨在闡明土壤微生物濃度、SMB及其化學計量比隨林齡的變化規律，厘清土壤微生物濃度、SMB及其化學計量比之間的互作效應，揭示土壤主要化學性質對其微生物化學計量變化的影響效應。通過全面掌握土壤質量狀況，為頂壇花椒人工林高效經營和管理措施制訂提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于貴州省關嶺縣花江鎮壩山村一帶，為中國典型的喀斯特高原峽谷地貌，海拔約 530—1473 m。屬亞熱帶季風氣候，年均降水量約 1100 mm，集中在5—10月，約占全年降水的83%，全年無霜期337 d；年均溫18.4 ℃，極端最高、低溫依次為 32.4、6.6 ℃。土壤以石灰巖為母質的石灰土為主，基巖裸露面積在 70%以上（Zou et al.，2019）。頂壇花椒采用幼苗移栽，期間依據林齡、樹冠和物候等特征進行經營管理，目前已成為該區相對穩定、種植面積最大的人工經濟林，另有核桃（Caryacathayensis）、玉米（Zeamays）、金銀花（Lonicerajaponica）、香椿（Toonasinensis）、李（Prunussalicina）、山豆根（Sophoratonkinensis）和柚木（Tectonagrandis）等伴生種。

1.2 土壤采集與處理

2020年7月，采用空間代替時間的方法，選擇立地因子基本一致的頂壇花椒人工林初始掛果期、旺盛掛果期、終止掛果期和衰老死亡期設置調查樣地（中心坐標：海拔 621 m，105°40′28.33″E、25°37′57.41″N），依次記為 YD1—YD4，由于頂壇花椒存在補植、補種等情形，因此林齡為區間值。4個齡級的林分均設置3個10 m×10 m的樣地（表 1），每個樣地內，距離樹干基部 30—50 cm范圍內（通常施肥范圍的10—30 cm區域），按照S型選取5個樣點，采集0—20 cm土壤制成混合樣，“四分法”保留鮮重約500 g，4個齡級共采集土樣12份。將土樣放置在無菌袋內，立即帶回實驗室。

表1 樣地基本情況Table 1 Basic information of sampling plots

所有樣品人工去除石塊、根系和動植物殘體后，過2 mm篩。篩出的樣品分成2份，其中1份放入冰箱于4 ℃下保存，于7日內完成土壤微生物濃度、SMB測定。另外1份自然風干后，研缽粉碎通過0.25 mm篩，用于測定土壤化學性質。

1.3 測試指標與方法

1.3.1 土壤微生物濃度測定

使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基培養細菌，在30 ℃培養箱中培養24 h后計數。使用馬丁-孟加拉紅培養基培養真菌，在25 ℃培養箱中培養72 h后計數。使用高氏 1號瓊脂培養基培養放線菌，在28 ℃培養箱中培養96 h后計數。細菌、放線菌采用平板計數法計數，真菌采用倒皿法計數（林先貴，2017；李雪萍等，2017）。

1.3.2 土壤微生物生物量測定

土樣先用氯仿薰蒸法進行處理，然后用 0.5 mol·L-1K2SO4溶液提取液，依次采用重鉻酸鉀硫酸外加熱法測定MBC、凱氏定氮法測定MBN；用0.5 mol·L-1NaHCO3溶液提取液，采用鉬藍比色法測定MBP，計算公式參照文獻（王理德等，2016）。

1.3.3 土壤化學性質測定

土壤有機碳（SOC）采用重鉻酸鉀外加熱法測定；全氮（TN）采用凱氏定氮法測定；全磷（TP）采用硫酸高氯酸氧化法測定；TK采用氫氟酸-硝酸-高氯酸消解-火焰光度計法測定；速效氮（AN）采用堿解擴散法測定；速效磷（AP）采用氟化銨-鹽酸浸提-鉬銻抗比色-紫外分光光度法測定；AK采用中性乙酸銨溶液浸提-火焰光度計法測定；pH采用電極電位法（鮑士旦，2000）測定，結果見表2。

表2 不同林齡頂壇花椒的土壤化學性質Table 2 Soil chemical properties in Zanthoxylum planispinum var.dintanensis of different forest ages

1.4 統計分析

應用Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0進行數據整理與統計分析。數據正態分布檢驗采用Kolmogorov-Smirnov法。滿足正態分布時，采用單因素方差分析（One-way AVOVE）和最小顯著差異法（Least significant difference，LSD）進行檢驗；不滿足時，采用Dunett’s T3法進行檢驗。土壤微生物因子間的相關性分析采用 Pearson相關性分析法。應用Origin 8.6制圖，R語言corrplot包繪制土壤參數相關熱性圖，Canoco 5.0進行土壤微生物化學計量與化學性質的冗余分析（redundancy analysis，RDA）。數據表達形式均為平均值±標準差，顯著與極顯著水平為P=0.05、0.01。

2 結果與分析

2.1 不同林齡土壤微生物濃度與生物量

土壤細菌、真菌和放線菌濃度分別為3.3×105—7.9×105、2.10×103—4.15×103、2.20×105—3.95×105CFU·g-1，表現為細菌>放線菌>真菌；土壤MBC、MBN和MBP質量分數依次為322.5—386.0、13.05—26.15、52.60—334.50 mg·kg-1，為MBC>MBP>MBN。土壤真菌濃度隨頂壇花椒林齡增加逐漸增大，細菌、放線菌濃度無顯著差異（P>0.05，下同），但數值上呈降低趨勢；土壤MBC隨頂壇花椒林齡增加未見顯著差異；MBN則先升高后降低，在YD3達到最高；MBP以YD4顯著低于其他3個樣地（P<0.05，下同）。除土壤真菌濃度、MBN、MBP外，細菌和放線菌濃度，以及MBC隨林齡增加均未發生顯著變化，表明林齡對同種植物土壤微生物濃度和SMB的影響規律不完全一致（圖1）。

圖1 不同林齡土壤微生物濃度、生物量Figure 1 The soil microbial concentration and biomass of different forest ages

2.2 不同林齡土壤微生物濃度與生物量化學計量特征

土壤細菌/真菌、真菌/放線菌變幅分別為0.80—3.70、0.54—1.89，隨頂壇花椒林齡增加，土壤細菌/真菌逐漸降低，真菌/放線菌則逐漸升高；土壤細菌/放線菌為1.38—2.39，隨林齡增長無顯著差異，數值上 YD1和 YD3略高于 YD2和 YD4。土壤MBC/MBN變化為12.90—29.58，在4個齡級間差異顯著，其中 YD1最高，YD3最低；土壤MBC/MBP、MBN/MBP依次為1.09—2.55、0.04—0.39，均以YD4為最高，與其他3個樣地存在顯著差異，隨林齡變化趨勢一致，表明土壤MBC、MBN較穩定（圖2）。

圖2 不同林齡土壤微生物濃度、生物量計量特征Figure 2 The measurement ratio of soil microbial concentration and biomass of different forest ages

2.3 土壤微生物濃度、生物量及其化學計量之間的相關性

土壤BAC與BAC/FUN、BAC/ACT為極顯著正相關（0.858、0.919），MBP與 MBC/MBP、MBN/MBP表現出顯著負相關（-0.810、-0.787），BAC/FUN與FUN/ACT、MBC/MBN呈顯著負相關、極顯著正相關（-0787、0.857）。土壤 ACT 與BAC/FUN是顯著正相關關系（0.801），暗示ACT與 BAC/FUN之間可以相互促進；土壤 MBN與MBC/MBN呈極顯著反向效應（-0.927），表明MBC/MBN受到 MBN的抑制；MBC/MBP與MBN/MBP之間呈極顯著增強效應（0.991），說明兩者間存在一定的協調性；土壤FUN/ACT與MBC的負相關性（-0.828）大于FUN/ACT與MBC/MBN的相關性（-0.780），表明MBC對FUN/ACT的反向作用更強。土壤微生物濃度與 SMB之間均無顯著相關性，土壤FUN與其他指標均無相關關系，說明土壤FUN穩定性相對較強，且土壤微生物濃度和SMB之間的相關性小于其化學計量比（圖3，表3）。

表3 土壤微生物濃度、生物量及其化學計量比之間相關系數Table 3 Pearson’s correlation coefficients of soil microbial concentration, biomass and their stochiometric ratios

圖3 土壤微生物濃度、生物量及其化學計量比之間的相關熱圖Figure 3 Correlation heat map among concentration,biomass and stoichiometric ratio of soil microorganisms

2.4 土壤化學性質對土壤微生物化學計量的影響

對頂壇花椒人工林土壤微生物化學計量（實心箭頭）與土壤化學性質（空心箭頭）進行冗余分析，結果顯示，土壤主要化學性質對化學計量的解釋率為99.78%（表4），AK、TK、SOC、pH、AP對土壤微生物化學計量的影響相對較大，其中AK呈顯著相關（表5）。土壤AK與MBP、MBC、BAC/FUN、ACT、MBC和MBC/MBN呈正相關，與FUN/ACT、MBN/MBP、MBC/MBP呈負相關；pH、SOC、TK與MBC、MBC/MBN呈正相關，與MBN則呈負相關；TP與MBN呈正相關，與MBC、MBC/MBN呈負相關。其他土壤化學性質與土壤微生物化學計量的相關性較弱（圖4）。

圖4 土壤微生物化學計量與土壤化學性質的冗余分析Figure 4 Redundancy analysis of soil microbial stoichiometry and soil chemical properties

表4 RDA分析的特征值、方差貢獻率及累計方差貢獻率Table 4 Eigenvalues, and their contribution to the variance of RDA

表5 部分土壤化學性質重要性測序和顯著性檢驗Table 5 Sequencing and remarkable test of portion soil chemical factors

3 討論

3.1 土壤微生物濃度及其化學計量隨林齡的變化

土壤微生物能夠表征土壤生態系統的穩定性，是最具潛力的敏感性生物指標之一（Cao et al.，2010；Xu et al.，2010），研究土壤微生物群落的化學計量特征，能較好地闡明土壤養分與質量動態變化規律（Wu et al.，2015；趙輝等，2020）。該文顯示，頂壇花椒人工林土壤細菌、真菌與放線菌具有差異，但總體上表現為細菌>放線菌>真菌，原因是喀斯特地區土壤多為中、堿性；同時樣品采于夏季，植物生長自身分泌的糖和淀粉為細菌提供食物來源（Krajick，2006），有利于細菌生長繁殖，但不利真菌生長，從而導致細菌濃度顯著高于真菌。各個齡級之間土壤微生物濃度均表現為細菌>放線菌>真菌，與總體微生物濃度變化趨勢一致，與王理德等（2016）研究結果相符，可能是林齡、土壤因子與小生境氣候等能夠改變局部土壤微生物群落，但整體上波動程度很小，優勢菌群仍是細菌，原因是石漠化過程常伴隨著強烈水土流失，帶走部分養分，導致土壤貧瘠（He et al.，2009；劉方等，2005），土壤微生物獲取資源途徑與總量受限，將更多的養分投入群落構建，維持微生物群落的穩定生長；其次與微生物自身具有一定的內穩性有關（Li et al.，2012；Song et al.，2019）。

細菌、真菌與放線菌是土壤微生物“三大菌”，占據有一定的生態位，可促進土壤生態系統 C、N周轉與能量循環，以及酶和有機酸等產生（Imberger et al.，2001），定量微生物的化學計量特征，能夠指示土壤質量。Ramos et al.（2003）研究表明，土壤FUB/ACT升高是土壤質量退化的標志，頂壇花椒生長初期FUB/ACT顯著低于后期（圖2C），說明其土壤質量隨生長年限增加而降低。究其原因，生長前期掛果旺盛，產量更高，植株生長需大量養分，人工施肥補給土壤養分以維持植株正常生長；生長后期掛果量大幅降低，開始進入衰老期，人為施肥停止，且有部分養分被果實帶走，管理更為粗放；其次，長期使用化肥導致土壤板結，影響土壤活性，凋落物分解歸還的那一部分養分僅能維持植物存活，從而導致土壤質量降低。土壤細菌/真菌（BAC/FUN）能夠表征木質素、纖維素的含量，通常呈正相關關系（Imberger et al.，2001）。隨林齡增加，該文土壤BAC/FUN呈降低趨勢，說明木質素和纖維素含量逐漸減小，原因可能是不同微生物類群的代謝方式和對底物的需求存在差異（Mitchell et al.，2013；Wang et al.，2013），生長后期土壤質量下降，細菌群落生長受到抑制，真菌數量有明顯上升趨勢（圖1A、B）。然而，本文未測定土壤中木質素、纖維素的含量，今后還需深入探討。Boyle et al.（2008）研究表明BAC/FUN可表征土壤生態系統的穩定性。該區BAC/FUN隨林齡增加逐漸減小，理論上頂壇花椒人工林土壤生態系統一定程度上朝穩定方向發展，但與林分衰退、土壤質量降低的事實不符，表明不同指標之間存在權衡關系，具體原因仍需深入研究。

3.2 土壤微生物生物量及其化學計量隨林齡的變化

土壤微生物 SMB是土壤礦質養分和有機質轉化和循環的動力，在植物營養和土壤肥力中作用顯著。本文中，土壤 MBC、MBN（352.3、18.7 mg·kg-1）顯著低于全球（680.4、105.0 mg·kg-1）平均水平，究其原因是，受長期施肥、翻耕和短輪伐期等人為活動影響，人工林土壤擾動頻繁，進而影響土壤微生物類群結構，不利于微生物生長與繁殖；土壤MBP（246.7 mg·kg-1）顯著高于全球（40.3 mg·kg-1）平均水平，說明生態系統受P限制的可能性較低，與喀斯特地區整體P虧缺的背景不一致，這可能與P肥施用有關，也可能受研究尺度制約，但具體原因尚需深入探明。不同生長階段林分結構、土壤底物、微生物群落結構和凋落物回歸量等存在差異，導致土壤SMB各異。該文土壤MBC在4個齡級間差異不顯著，說明土壤MBC較為穩定，林齡對土壤MBC轉化和遷移影響很小。土壤MBN隨林齡增加先逐漸升高后降低（圖1E），與王雪梅等（2017）結果相反，原因可能是受氣候、土壤、降水以及地表植被類型等因素的綜合影響。28—32年的土壤MBP顯著低于其他3個齡級（圖1F），說明長期施肥、除草劑使用等抑制了微生物的活性與生長繁殖，在不同齡級間土壤TP含量無顯著差異（表2），低微生物活性對土壤P活化效率小，進而影響土壤MBP。

土壤微生物生物量C∶N∶P化學計量是微生物活動方向和凋落物分解過程養分釋放與否的決定性因素（Heuck et al.，2015），影響土壤養分的有效性。全球土壤MBC/MBP、MNC/MBN與MBN/MBP依次為 59.5、3—24 和 1—55（Cleveland et al.，2007），該區僅有MNC/MBN（12.9—29.58）在全球數據范圍內，MBC/MBP（1.09—6.64）、MBN/MBP（0.04—0.39）均低于全球范圍，說明該區土壤養分相對虧缺，原因是頂壇花椒為經濟植物，果實采摘帶有部分養分，加之該區強烈的巖溶作用導致養分大量流失。土壤 MBC/MBN可作為微生物群落變化的指標，一般MBC/MBN為3—5時，細菌為優勢菌落，其值為4—15時，真菌為優勢菌群（Paul et al.，1996；Zhou et al.，2015）。本研究中，土壤MBC/MBN在4個齡級間差異顯著，僅有 20—22年人工林土壤MBC/MBN（12.90±0.45）在該范圍內，其他均高于該值域，與土壤MBC/MBN越高，真菌生物量越多的結論不符（圖1E，圖2D），說明頂壇花椒林齡改變后，土壤微生物群落結構發生了局部轉變，但優勢菌群未改變，這佐證了該區微生物將更多養分投入到群落構建的觀點。推測與前人結論不符的原因是，不同研究尺度、土壤因子和人為干擾程度等均會影響土壤微生物群落結構及活性，但最重要的具體潛在驅動因素仍有待分析。

3.3 土壤微生物化學計量間的相關性及其影響因素

該區土壤微生物濃度、SMB化學計量間均不存在相關性，除土壤FUN外，微生物濃度、SMB化學計量及兩者之間均有著一定的相關性（表 3），這與微生物的內穩定性有關。洪丕征等（2016）研究發現，紅椎（Castanopsishystrix）和格木（Erythophleumfordii）人工林幼齡期土壤 FUN 與MBC顯著正相關、BAC/FUN與MBC/MBN無顯著相關，本文結果與之相反，表明植被類型、林齡等會影響微生物群落結構，以同步響應土壤狀況。

該區YD1的土壤pH更高，其細菌濃度較高、真菌濃度較低，而YD3則反之（表1，圖1A、B），且RDA分析顯示pH與細菌正相關、與真菌負相關（圖4），說明pH一定程度上能夠影響微生物群落結構，這一結論已被證實（Hǒgberg et al.，2007；Fenández-Calvino et al.，2010；Cao et al.，2010）。土壤SOC、TK與MBC正相關，與MBN、MBP負相關，TP與MBN、MBP正相關，與MBC負相關，說明土壤養分對微生物SMB存在促進或抑制效應，原因是土壤養分能夠調控微生物群落結構，微生物吸收養分時受土壤養分條件劇烈影響（Zhang et al.，2020；王傳杰等，2018），這表明土壤微生物在一定程度上依賴土壤養分。除土壤MBC/MBN外，土壤SOC、TK、TP與MBC/MBP、MBN/MBP間相關性較弱，可見頂壇花椒人工林土壤 SMB計量比對土壤養分的依賴程度相對較小，能夠保持一定的自穩定性。土壤微生物化學計量與AK顯著相關（圖4），這可能是土壤微生物中解 K菌活化土壤 AK（王薪琪等，2017），推測該區細菌的主要菌種之一可能是解K菌。該文未測定“三大菌”的具體種類，今后應當予以加強。

林齡驅動土壤性質發生動態變化，通過改變土壤微生物群落結構與活性，從而影響微生物的化學計量特征。本研究得出，TK、AK和pH等是調節土壤微生物群落的主要因子，合理施加K肥和調節土壤pH值，是頂壇花椒人工林經營管理的關鍵措施之一，且緩效態和速效態養分的功能均應得到重視；提供優勢微生物類群生長與繁殖所需的營養物質，滿足所需的底物，是人工林培育的關鍵環節。研究結果對指導頂壇花椒人工林土壤養分管理，具有一定的理論和實踐價值。

4 結論

（1）隨頂壇花椒人工林生長進程，土壤微生物群落發生了局部改變，但優勢菌群未改變，表明研究區土壤微生物主要將養分投入到群落構建中；土壤FUB/ACT暗示該區頂壇花椒人工林種植后期土壤質量總體降低。

（2）該區土壤養分相對虧缺，但受P限制的可能性較小；土壤MBP在28—32 a顯著低于其他3個齡級，說明長期施肥、除草劑使用等抑制了微生物的活性與生長繁殖。

（3）冗余分析表明，土壤微生物 SMB對土壤養分依賴性強于其計量比，其中土壤TK、AK、pH等是土壤微生物化學計量變化的主要影響因子，該區土壤微生物化學計量與部分化學性質具有趨同效應，并受土壤pH值調節，培育過程中應適當施用K肥。