不同粒徑的聚乙烯微塑料對玉米和黃瓜種子發芽和幼苗生長的影響

劉曉紅，劉柳青青，栗敏，劉強，曹東東，鄭浩, ，羅先香, *

1.中國海洋大學近海環境污染控制研究所/海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東 青島 266100；2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態與環境科學功能實驗室，山東 青島 266071

微塑料（Microplastics，MPs）指尺寸小于5 mm的塑料纖維、顆粒和碎片等（Thompson et al.，2004；Xu et al.，2020）。MPs廣泛存在于農田土壤中。例如，智利大都會地區農田土壤中 MPs豐度范圍為600—10400 ind·kg-1（Corradini et al.，2019），韓國中西部地區農田土壤中MPs豐度范圍為10—7630 ind·kg-1（Kim et al.，2021）。中國山東壽光農田土壤中MPs豐度范圍為310—5698 ind·kg-1（Yu et al.，2021），陜西省19個市縣農田土壤中MPs豐度范圍為 1430—3410 ind·kg-1（Ding et al.，2020），云南滇池南部柴河流域農田土壤中 MPs豐度高達7100—42960 ind·kg-1（Zhang et al.，2018）。

農業地膜是農田土壤中MPs主要的來源之一，其低的回收率和難降解性導致 MPs在農田土壤中廣泛殘留（Qi et al.，2020）。2020年，中國農用地膜使用量高達135.7×104t，約占世界總量的70%（靳拓等，2020；中國農村統計年鑒委員會，2021）。農用地膜的主要成分為聚乙烯（Polyethylene，PE）和聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC），其中，PE占比高達60%左右（Ren et al.，2021）。由于塑料的降解周期長并含有多種化學添加劑，MPs已成為土壤生態系統中的持久性有害物質（Ren et al.，2021），對植物生長產生影響。MPs對植物的影響與植物類型、MPs的種類、粒徑和濃度有關。例如，在同一植物群落中，添加量0.4%的聚酯纖維微塑料顯著促進了拂子茅（Calamagrostisepigeios(L.) Roth）的生長，但絨毛草（HolcuslanatusL.）的生長受到顯著抑制（Lozano et al.，2020）。野胡蘿卜（DaucuscarotaL.）隨著聚醚砜、聚酰胺和聚丙烯纖維微塑料的質量分數從0.1%增加到0.4%，其生物量隨之增加，但隨著聚酯和聚丙烯薄膜微塑料質量分數的增加其生物量隨之降低（Lozano et al.，2021）；粒徑 200—250 μm的PE，在0.5%—2%暴露質量分數范圍內，小麥（TriticumaestivumL.）地上部鮮重隨著微塑料濃度的增加而增加，而在2%—8%的范圍內地上部鮮重隨著微塑料質量分數的增加而減小（Liu et al.，2021）。一種粒徑為 50、500、4800 nm，103—107plastics·mL-1的綠色熒光塑料顆粒顯著降低了英菜（LepidiumSativumL.）的發芽率，且隨著粒徑的增加抑制作用增強（Bosker et al.，2019）；在質量分數為1%的MPs暴露下，片狀PE（6.92 mm×6.10 mm）顯著降低了小麥根生物量，而顆粒狀PE（粒徑為0.05—1 mm）對小麥根生物量無顯著影響（Qi et al.，2018）。綜上所述，MPs的類型、粒徑和濃度均會影響植物的生長，但其交互作用對植物的生長的影響并不清楚。

本文選取2種典型農作物主糧玉米（ZeamaysL.）和蔬菜黃瓜（CucumissativusL.）作為供試植物，探究3種粒徑的PE在不同濃度下對2種植物種子發芽、幼苗生長和根系形態的影響，探討了PE粒徑、濃度和二者的交互作用對農作物生長的潛在影響，以期為微塑料對農作物的生態評價毒性效應提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用 MPs為廣泛用于制備農業地膜原料的聚乙烯微塑料顆粒。3種PE的平均粒徑分別為13、58和178 μm，分別命名為PE13、PE58和PE178。供試玉米品種為丹玉86號，黃瓜品種為盛達3號。

實驗土壤為山東省招遠市（37.43N，120.33E）農田表層土（0—20 cm）。土壤樣品經自然風干，剔除石塊和植物殘渣等雜質，磨碎過2 mm不銹鋼篩備用。土壤pH為4.98，總氮含量為0.17%，總碳含量為1.37%。

1.2 微塑料的表征

掃描電鏡（Jeol7610F）分析PE顆粒的表面形態結構特征，X射線光電子能譜儀（XPS，Thermo Scientific K-Alpha，美國）測定表面元素含量。

PE顆粒和水按1∶20質量比在40 mL頂空瓶中進行添加劑浸出實驗。頂空瓶置于震蕩箱 25 ℃黑暗條件以 150 r·min-1震蕩 7 d，溶液過 0.45 μm 聚四氟乙烯膜，保存濾液備用（Luo et al.，2019）。pH計法測定濾液pH，TOC分析儀（Elementar TOC-Vcpn，Shimadzu，日本）測定濾液溶解有機碳含量（DOC），電感耦合等離子體質譜儀（NexION 350，PerkinElmer，美國）分析濾液重金屬含量。

1.3 種子發芽實驗

將顆粒均勻飽滿的玉米和黃瓜種子浸泡在 3%H2O2溶液中消毒30 min，使用絹布分離出種子，蒸餾水沖洗 3次后置于飽和 CaSO4溶液中浸泡 12 h后備用。處理好的種子置于直徑為90 mm培養皿內以去離子水為基質進行發芽試驗。發芽試驗中 PE設置5個質量分數梯度，分別為0、0.1%、0.5%、1%和2%，3種粒徑PE，每種植物15個處理，每個處理4個重復。每皿10粒種子，每粒種子之間的間距大于1 cm（Yang et al.，2005）。培養皿置于(25±1) ℃的恒溫培養箱中，黑暗培養7 d，每天補水保持水分恒定。第7天用直尺測定芽長、根長并計算種子的發芽率RG、發芽勢PG和種子活力指數IV（Lian et al.，2020；王波，2018）。

式中：

Nm——日發芽種子數最大時的發芽數；

NG——萌發種子數；

N——供試種子數；

lg——芽長；

lr——根長。

1.4 盆栽實驗

以同樣的玉米和黃瓜種子進行盆栽實驗。每種PE按質量分數0、0.1%、0.5%、1%和2%與80 g土壤充分混合，混合后的土壤放入育苗盒中，加入20 mL蒸餾水活化兩天后將浸泡過夜的種子置于育苗盒高度的1/3處，每盆放置3粒種子。每種植物15個處理，每個處理 3個重復。保持土壤水分為田間最大持水量的 60%，每天光照 12 h，光照強度為30000 lx。30 d培養結束后，測量作物的株高，用蒸餾水將農作物根部沖洗干凈，濾紙吸干水分，分離地上部和地下部，稱質量得到植物鮮質量。利用根系掃描儀（10000XL，Epson Scanning，日本），運用WinRHIZO軟件（Prp.2005，Regent，加拿大）分析根系形態。最后，植物在105 ℃下殺青30 min，60 ℃保持恒溫72 h，取出烘干后稱質量得到植物干質量。PE58和PE178為同一批次試驗，PE13為補充批次試驗，不同批次試驗處理和過程完全一致。

1.5 數據分析

實驗結果以平均值±標準偏差表示。使用Excel 2016和Origin 2021進行實驗結果的處理分析及圖表繪制，使用SPSS 23.0對實驗數據進行顯著性差異分析（Duncan檢驗，P=0.05），雙因素方差分析（Two-Way ANOVA）探討PE質量分數、粒徑及二者的交互作用對種子發芽、幼苗生長和根系形態的影響，CANOCO 5.0軟件分析微塑料特性與種子發芽、幼苗生長、根系形態的關系，所有數據均進行lg(x+1)轉換，對種子發芽、幼苗生長、根系形態數據進行去趨勢對應分析（DCA），排序軸梯度長度小于3時，適用基于線性的冗余分析方法（RDA），應用Monte Carlo法進行相關性檢驗。

2 結果

2.1 微塑料的特性

3種粒徑的PE表面特征SEM和XPS全程譜如圖1所示。PE13粒徑范圍約為10—30 μm，其表面呈褶皺片層狀結構（圖1a、d）；PE58的粒徑范圍約為40—60 μm，多數為近似球形，且表面有凹陷和裂痕（圖1b、e）；PE178粒徑約為150—200 μm，大多近似球形，有少數呈棒狀，其表面存在凹陷和裂痕（圖1c、f）。3種PE表面除了含有碳原子外，PE13表面還含有0.72%的氧原子（圖1g），PE 58表面含有1.06%氧原子和1.60%的氮原子（圖1e），PE178表面含有0.76%的氧原子（圖1i）。

圖1 PE表面特征掃描電鏡圖（a—f）和X射線光電子能譜全程譜圖（g—i）Figure 1 Scanning electron microscopy (a to f) and X-ray photoelectron spectroscopy (g to i) of surface characteristics of PE

表1為PE浸出液pH、DOC和重金屬質量濃度。與空白對照組（CK）相比，PE13浸出液的DOC、重金屬Cu和Zn的質量濃度顯著升高，PE58浸出液的pH顯著降低，DOC和重金屬的質量濃度（Cd除外）顯著升高，PE178浸出液中Zn的質量濃度顯著升高。PE58浸出液中DOC、重金屬Pb和Cr質量濃度顯著高于PE13和PE178，Cd質量濃度顯著高于PE178，這說明相比于另外兩種粒徑的PE，PE58中含有較多的塑料添加劑。

表1 PE微塑料的物理化學性質Table1 The physicochemical properties of PE microplastics

2.2 微塑料對種子發芽的影響

圖2所示為PE對玉米和黃瓜種子發芽和生長的影響。1%的PE13顯著降低了玉米種子的發芽率，2%的PE13使其發芽勢和發芽率均顯著降低；質量分數小于 1%的 PE58均顯著降低了玉米種子的發芽勢和發芽率，1%和 2%的PE58顯著降低了黃瓜種子的發芽勢和發芽率，且隨質量分數的增加抑制作用增強；PE178對玉米和黃瓜種子的發芽勢和發芽率均無顯著差異（圖2a—d）。Two-Way ANOVA顯示，PE的粒徑、質量分數及二者的交互作用均顯著影響玉米種子的發芽勢和發芽率，而僅PE的質量分數對黃瓜種子的發芽率和發芽勢有顯著影響。與粒徑相比，PE的質量分數是影響兩種植物種子發芽的最主要因素。

圖2 PE對玉米（a、c、e、g）和黃瓜（b、d、f、h）種子萌發的影響Figure 2 Effects of PE on seed germination of maize (a, c, e, g) and cucumber (b, d, f, h)

續圖2 PE對玉米（a、c、e、g）和黃瓜（b、d、f、h）種子萌發的影響Continued figure 2 Effects of PE on seed germination of maize (a, c, e, g) and cucumber (b, d, f, h)

0.5%、1%和2%的PE13、2%的PE58、1%和2%的PE178均顯著降低了玉米的芽長，且質量分數越大抑制作用越強（圖2e）。PE13對黃瓜根的生長顯示出低促高抑特征；0.5%、1%和2%的PE58和PE178均顯著降低了黃瓜的芽長和根長，且質量分數越大抑制作用越強（圖2f）。Two-Way ANOVA顯示，PE的質量分數對玉米和黃瓜芽長均有顯著影響，但粒徑對芽長無顯著影響；PE的粒徑、質量分數及粒徑和質量分數的交互作用均顯著影響黃瓜的根長。

種子活力指數反映了種子的活力。2%的 PE13顯著抑制了黃瓜種子活力；PE58在所有質量分數下均顯著抑制了玉米種子活力，在1%和2%時顯著抑制了黃瓜種子活力；PE178在質量分數為0.5%、1%和2%時，顯著抑制了玉米和黃瓜的種子活力，且隨著質量分數增加，抑制作用增強（圖2g、h）。Two-Way ANOVA顯示，PE的粒徑和質量分數均顯著影響玉米和黃瓜種子的活力，但二者的交互作用僅對玉米種子的活力有顯著影響。與粒徑相比，質量分數是影響2種植物種子活力的最主要因素。

2.3 微塑料對農作物幼苗生長的影響

圖 3所示為 PE對玉米和黃瓜幼苗生長的影響。0.1%的PE13顯著增加了玉米株高，0.5%和1%的 PE178顯著降低了玉米株高（圖 3a），0.5%的PE58顯著降低了黃瓜株高（圖 3b）。Two-Way ANOVA顯示，PE的粒徑、質量分數及二者的交互作用均顯著影響玉米的株高，且PE的粒徑效應更顯著；PE的質量分數和粒徑對黃瓜株高影響不顯著。2%的 PE13顯著降低了玉米地上部鮮質量，PE178質量分數為1%時顯著降低了玉米地下部鮮質量（圖3c）。PE58在所有質量分數下均顯著降低了黃瓜地上部鮮質量，在0.1%和0.5%時顯著降低了黃瓜地下部鮮質量；1%和 2%的 PE178顯著降低了黃瓜地上部鮮質量，在質量分數0.5%、1%和2%時顯著降低了黃瓜地下部鮮質量（圖3d）。Two-Way ANOVA顯示，PE的質量分數對玉米地下部鮮質量有顯著影響，但沒有粒徑效應；PE對黃瓜的地下部鮮質量有顯著的粒徑效應，但PE的質量分數對黃瓜的地下部鮮質量無顯著影響。0.1%的PE58 顯著降低了黃瓜地上部和地下部干質量，0.5%的 PE58顯著降低了黃瓜地下部干質量；PE178在質量分數 1%和 2%時顯著降低了黃瓜地上干質量，0.5%和1%時顯著降低了黃瓜地下部干質量（圖3f）。Two-Way ANOVA顯示，PE的粒徑、粒徑和質量分數的交互作用顯著影響黃瓜地下部干質量，且粒徑效應更顯著。

圖3 PE對玉米（a、c、e）和黃瓜（b、d、f）幼苗生長的影響Figure 3 Effects of PE on seedling growth of maize (a, c, e) and cucumber (b, d, f)

2.4 微塑料對農作物根系形態的影響

圖4所示為3種粒徑的PE對玉米幼苗根系形態的影響及 PE13對黃瓜幼苗根系形態的影響。PE13在質量分數0.1%和0.5%下顯著增加了玉米根體積和根表面積。PE58和PE178對玉米的根長、根體積、根表面積和根尖數均無顯著影響。PE13在質量分數 2%時顯著增加了黃瓜根長、根表面積和根尖數，在質量分數1%時顯著增加了黃瓜根尖數。PE對玉米幼苗根系形態的Two-Way ANOVA顯示，PE的質量分數對玉米根體積和根表面積有顯著影響，PE的粒徑對玉米根長、根體積、根表面積和根尖數有顯著影響，質量分數和粒徑的交互作用對玉米根體積和根尖數有顯著影響，PE對玉米的根尖數的粒徑效應更顯著。

圖4 PE對玉米和黃瓜根系形態的影響Figure 4 Effects of PE on root morphology of maize and cucumber

3 討論

本文利用RDA分析討論了PE的粒徑、質量分數和浸出物對玉米和黃瓜種子發芽、幼苗生長及根系形態的影響（圖5）。玉米的RDA排序結果顯示，前兩個排序軸的特征值為0.471和0.040，玉米生長發育的各項指標與PE特性在第一軸和第二軸的相關系數為0.847和0.636。黃瓜的RDA排序結果顯示，前兩個排序軸的特征值為0.257和0.067，黃瓜生長發育的各項指標與PE特性在第一軸和第二軸的相關系數為0.838和0.661。Monte Carlo置換檢驗所有排序軸均達到顯著水平（P<0.05），說明排序軸是可靠的。PE特性的篩選采用向前映入法（Forward selection），保留能通過Monte Carlo置換檢驗的顯著因子。其結果顯示，與玉米生長發育有顯著相關的因子包括PE的粒徑、質量分數、浸出液重金屬Zn和Cu質量濃度，與黃瓜生長發育有顯著相關的因子包括PE的粒徑、質量分數、浸出液DOC、重金屬Zn和Cu質量濃度。

圖5 PE特性與玉米（a）和黃瓜（b）種子發芽、幼苗生長狀況的冗余分析Figure 5 Characteristics of PE and redundancy analysis of seed germination and seedling growth of maize (a)and cucumber (b)

玉米的發芽根長、幼苗株高、幼苗根長、根體積和根表面積與PE粒徑呈顯著負相關，黃瓜的發芽根長、種子活力指數和幼苗干質量與PE粒徑呈顯著負相關。這說明隨著粒徑的增加，PE對玉米和黃瓜發芽和生長的負面影響越明顯。其可能的原因是隨著粒徑的增加，PE對植物根系產生更強的機械損傷，誘導植物的氧化應激，抑制了根的發育和植株的生長（Pehlivan，2021；Guo et al.，2022）。玉米的芽長、幼苗的根體積和根表面積與PE的質量分數呈顯著負相關；黃瓜的芽長、根長和種子活力指數與PE的質量分數呈顯著負相關。這說明隨著PE質量分數的增加，PE對玉米和黃瓜發芽和生長的負面影響越明顯。其可能的原因是PE質量分數越高，引起植物氧化應激產生的ROS水平越高，會導致更嚴重的組織和細胞氧化損傷、細胞和基因毒性，從而抑制植物根的發育（Giorgetti et al.，2020）。此外，隨PE質量分數增加，積累在植物根系的微塑料量會增加，導致水分和養分吸收阻礙，從而抑制植物種子發芽和幼苗根系生長（Bosker et al.，2019；Sun et al.，2020；Urbina et al.，2020）。

黃瓜的種子發芽勢和發芽率、玉米和黃瓜種子的芽長和根長、黃瓜的種子活力指數、玉米幼苗根長、根體積和根表面積與PE浸出液的重金屬Zn質量分數呈顯著負相關，玉米和黃瓜種子的發芽勢和芽長、黃瓜的種子發芽的根長和種子活力指數、玉米幼苗的根長與 PE浸出液的重金屬 Cu呈顯著負相關。這說明隨著浸出液中Cu和Zn質量分數的增加，PE對玉米和黃瓜發芽和生長的負面影響越顯著。可能的原因是隨著重金屬（Zn、Cu）質量分數增加，重金屬可能通過增加根細胞膜通透性，降低酶的活性，誘導氧化應激，抑制了種子的萌發和根的生長（Cheng，2003；Esmaeilzadeh et al.，2017；Kova?evi? et al.，2020；Riyazuddin et al.，2021）。黃瓜的種子的發芽勢、芽長、根長和種子活力指數與PE浸出液中的DOC呈顯著負相關。DOC質量分數越高表明PE釋放的有機添加劑越多，XPS分析結果也顯示PE表面含有少量氧和氮，這進一步說明了PE中可能添加了一些含氮和氧元素的阻燃劑、光穩定劑和塑化劑等有機添加劑，微塑料中主要的有機添加劑是塑化劑，包括鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯、鄰苯二甲酸二辛酯等（Wang et al.，2013；Hahladakis et al.，2018；Fauser et al.，2022）。這些有機添加劑可能抑制淀粉酶活性，減少種子萌發養分，誘導植物氧化應激（Gao et al.，2017），從而抑制黃瓜種子萌發和生長。

4 結論

（1）3種粒徑 PE對玉米和黃瓜種子發芽和幼苗生長存在顯著的毒性效應，且在種子萌發階段玉米和黃瓜對PE污染更加敏感。PE13對玉米和黃瓜的根系形態影響顯著，促進了根的發育。

（2）PE對玉米和黃瓜種子發芽、幼苗生長和根系形態發育均存在不同程度的粒徑效應和質量分數效應。隨著粒徑的增大和質量分數的增加，PE的負面效應更加顯著。其中PE的質量分數對兩種植物種子的發芽影響更顯著，而對幼苗的生長和根系形態，PE的粒徑效應更顯著。

（3）PE的浸出的重金屬和有機添加劑對玉米和黃瓜種子發芽有一定的毒性效應，RDA分析結果顯示隨著PE浸出物重金屬和添加劑質量分數的增加，其毒性效應增強。