蜈蚣草根際及內生微生物群落對砷污染脅迫的響應機制研究

高鵬，高品，孫蔚旻，孔天樂, ，黃端儀，劉華清，孫曉旭*

1.東華大學環境科學與工程學院，上海 201620；2.廣東省科學院生態環境與土壤研究所，廣東 廣州 510650

砷（arsenic，As）是一種在自然界普遍存在的有毒類金屬（Sun et al.，2019），往往以伴生或共生形式賦存于多種（類）金屬礦藏中，是開采（類）金屬礦產資源過程中常見的類金屬污染物（仇榮亮等，2009）。金屬礦物提取過程中，砷以廢渣、廢水和廢氣的形式被釋放到礦區周邊環境，對周邊土壤、水、植物和人類健康造成嚴重威脅。土壤是地球之膚，也是農作物生長的載體，土壤砷污染會導致農作物砷積累，進而危害人體健康（焦常峰等，2020）。有研究報道，亞洲最大的湖南石門雄黃礦周邊農用土壤砷質量分數達1300 mg·kg-1，超出中國土壤環境質量標準（GB 15618—2008）中二級標準值的29倍以上（Tang et al.，2016），而與之毗鄰的錫礦山礦區周邊土壤中砷質量分數（2431.81 mg·kg-1）同樣遠超當地土壤背景值（莫昌琍等，2013）。研究表明，無機態砷（三價砷和五價砷）是砷污染土壤的主要賦存形式，其化合物均屬劇毒性物質（Sun et al.，2020）。砷暴露無處不在，當攝入砷過多時會對人體皮膚和神經系統造成危害，增加人類慢性和急性疾病風險，甚至導致癌變（韓永和等，2017）。因此，對砷污染土壤進行修復亟待開展。

砷污染土壤修復技術主要包括物理、化學和植物修復技術（熊金波，2010）。傳統物理和化學修復技術成本高，會產生二次污染，從而使得成本低、效果理想、環境友好的植物修復技術備受關注（許飛飛，2017）。植物修復是利用植物及其根際微生物原位修復污染土壤的技術。砷的植物修復技術主要通過砷超富集植物對砷實現超累積（Chen et al.，2002），從而達到修復砷污染土壤的目的（陳同斌等，2010）。蜈蚣草（PterisvittataL.）是世界上第一種被發現具有砷超累積能力的植物（Ma et al.，2001），其對砷具有高耐受性、超強吸收能力和轉運能力等特點（葉文玲等，2014），因此被認為是一種砷污染土壤修復理想的植物（Cantamessa et al.，2020）。

蜈蚣草對土壤中砷的超累積作用主要是通過其根部對砷酸鹽的吸收和轉化作用，使砷酸鹽還原成亞砷酸鹽，而亞砷酸鹽通過木質部導管介導的長距離運輸到達地上部分，最后通過液泡區隔化作用在羽葉液泡中聚集而富集（Han et al.，2016）。目前，關于蜈蚣草富集砷的研究主要針對植物砷還原酶和砷轉運機制，而對微生物促進砷在土壤-蜈蚣草系統中的轉運作用機制研究較少。據報道，接種微生物不僅可增強蜈蚣草對砷的富集能力，還能提高其生物量（趙根成等，2010）。Han et al.（2017a）在無菌條件下，向培養蜈蚣草的含砷培養基中接種砷還原菌，結果發現蜈蚣草對砷的吸收增加了47%，且生物量提高了20%—74%。Yang et al.（2020）對接種微生物的蜈蚣草進行為期3年的田間試驗，發現接種微生物后提高了蜈蚣草的生物量和砷積累量。有研究表明，微生物對砷的解毒機制是通過砷的還原、氧化以及甲基化等轉化過程實現（陳焱山等，2018），但目前對土壤-蜈蚣草系統內微生物群落對砷污染的響應機制研究還鮮有報道。因此，本研究以蜈蚣草作為供試植物，通過不同砷添加量梯度脅迫進行盆栽試驗，結合理化分析、高通量測序和生物信息學等手段，對蜈蚣草根際土、根和莖葉中砷含量及微生物群落結構進行表征和分析，以揭示砷污染對蜈蚣草根際及內生微生物群落結構的影響，探討土壤-蜈蚣草系統中微生物對砷污染的響應機制，旨在為蜈蚣草相關微生物群落潛在功能研究提供一些新的見解，有助于提高對植物-功能微生物聯合修復砷污染土壤的實踐指導。

1 材料與方法

1.1 土壤采集及老化

實驗所用土壤采自廣東省生態環境與土壤研究所（23°18′68.19″N，113°36′23.73″E）內無污染土壤，為了防止表面植物對土壤中微生物群落的影響，在采集土壤時去除了表層5 cm的土壤。土壤采集完后，經自然曬干、磨碎、過0.147 mm篩，放置備用。稱取備用土壤2 kg于PV花盆中，并向其中加入不同添加量砷酸鈉（Na3AsO4）溶液，使土壤最終砷質量分數分別為0、250、500 mg·kg-1，最后將處理后的花盆置于黑暗處進行一個月的老化。

1.2 盆栽試驗

供試蜈蚣草采自廣東省韶關市新丘屋的砷污染場地（24°31′10.92″N，113°43′14.45″E），為了避免蜈蚣草成熟莖葉的影響，在移植前去掉成熟的莖葉，僅保留剛發芽的嫩芽，并在移至盆栽前用去離子水沖洗掉附著在根表面的土，以防對盆栽土壤中砷含量的干擾。

盆栽試驗中，不同砷添加量處理各設置3個平行，共9盆。該試驗于廣東省科學院生態環境與土壤研究所人工大棚中進行，自然采光，蜈蚣草種植期間通過質量法補給水分，控制盆栽土壤含水量為最大持水量的80%。

1.3 根際土及植物樣品采集

待蜈蚣草成熟后，分別采集蜈蚣草根際土、根和莖葉。在采集蜈蚣草時，用手輕輕抖動蜈蚣草根部，將蜈蚣草根部的土抖落后收集其根部附著土至自封袋內，即為根際土樣品。采集完根際土后，用剪刀將蜈蚣草根和莖葉分開，分別收集至自封袋中。

采集完的根際土分為兩份，一部分樣品置于60 ℃烘箱進行48 h烘干，隨后經研磨和過0.147 mm篩后用于理化參數測定，另一份放入-20 ℃冰箱保存，用于微生物DNA的提取與鑒定。將收集的蜈蚣草根和莖葉樣品均分別分為兩份，一份經去離子水清洗后置于60 ℃烘箱進行48 h烘干，隨后經研磨、過0.147 mm篩以待理化測定。為了防止植物樣品表面的細菌影響后續DNA提取，另一份需要進行滅菌處理，滅菌方法參考（Sun et al.，2021），后將滅菌后的植物樣品保存至-20 ℃，以待DNA提取。

1.4 總砷測定

土壤樣品總砷測定：稱取 0.1 g研磨過篩后的根際土樣品于石墨爐消解管中，并向消解管中加入3 mL HCl、3 mL HF和9 mL HNO3，隨后使用DS-360石墨消解爐（廣州格丹納儀器有限公司）消解8 h，消解后所有消解液使用超純水定容至10 mL，并用0.22 μm濾膜過濾定容后的消解液。消解液的總砷添加量采用AFS-9710原子熒光光度計（北京海光儀器有限公司）測定。植物樣品總砷測定：稱取0.1 g研磨過篩后的植物樣品于石墨爐消解管中，并向消解管中加入3 mL HCl和9 mL HNO3，隨后使用 DS-360石墨消解爐（廣州格丹納儀器有限公司）消解5 h，消解后所有消解液使用超純水定容至10 mL，并用0.22 μm濾膜過濾。消解液總砷質量分數采用AFS-9710原子熒光光度計（北京海光儀器有限公司）測定。

1.5 DNA提取和測序

將滅菌后的植物樣品用液氮速凍后研磨，并采用 DNeasy PowerSoil試劑盒（德國德累斯頓的Qiagen）對研磨后的植物樣品以及準備好的土壤樣品進行 DNA提取。DNA濃度采用 Qubit? 3.0 Fluorometer（美國invitrogen公司）進行測定。

本研究采用Illumina高通量測序技術研究蜈蚣草根際土、根及莖葉中微生物群落結構多樣性，并以16S rRNA基因V4高變區的515 F/806 R引物錨定總微生物群落（Caporaso et al.，2010），后將基因的擴增子進一步于Illumina MiSeq系統（上海派森諾生物技術公司）進行編碼、匯集及測序，并將測序結果原始序列提交到NCBI數據庫。

1.6 富集系數及轉運系數

富集系數（BCF）是指植物不同組織中砷含量與土壤中砷含量之比，轉運系數（TF）是指植物上部某元素的質量分數與植物下部某元素的質量分數之比。BCF和 TF的計算公式如下（Takarina et al.，2017）：

式（1）中：

XBCF——富集系數（BCF）；

ws,r——莖葉（S）或根（R）中砷的平均質量分數（mg·kg-1）；

wso——土壤中砷的平均質量分數（mg·kg-1）；

式（2）中：

XTF——轉運系數（TF）；

Cs——莖葉中砷的平均質量分數（mg·kg-1）；

Cr——根中砷的平均質量分數（mg·kg-1）。

1.7 數據處理

本研究使用QIIME2中的DADA2方法對原始雙端 Illumina reads進行分析（Bolyen et al.，2019）。使用R語言中“Vegan”軟件包進行多變量分析。采用Observed指數、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數計算蜈蚣草根際及內生微生物群落的α多樣性指數。基于Bray-curtis距離分別計算3種根際及內生微生物群落結構的β多樣性（Schroeder et al.，2018）。并用“MicrobiomeSeq”軟件包計算出的蜈蚣草根際及內生微生物群落的核心微生物，砷添加量與微生物群落之間的相關性和可視化是在“Corrplot”軟件包中進行的（Jia et al.，2021）。

2 結果

2.1 蜈蚣草根際土、根及莖葉砷富集情況

蜈蚣草根際土、根及莖葉均有富集砷的作用，在0、250、500 mg·kg-1砷污染下，蜈蚣草根際土、根和莖葉內砷含量具有顯著差異（圖1）。蜈蚣草根際土、根和莖葉的砷含量表現為：莖葉>根際土>根。隨著砷污染水平遞增，蜈蚣草各個部位的砷積累量均明顯提高。其中，在土壤中砷污染水平為 250 mg·kg-1時，蜈蚣草莖葉砷質量分數為 22816.04 mg·kg-1，遠高于根和根際土的砷質量分數，其分別為 220.37 mg·kg-1和 228.18 mg·kg-1；與之類似，當砷污染水平500 mg·kg-1時，蜈蚣草莖葉、根及根際土砷質量分數分別為 31334.64、333.40、468.84 mg·kg-1。同時，基于BCF和TF計算，發現當土壤砷污染水平為 250 mg·kg-1和 500 mg·kg-1時，蜈蚣草莖葉中砷的富集系數分別為99.99和66.83，轉運系數分別為103.53和93.98。這表明蜈蚣草具有很強的土壤砷修復潛力。

圖1 不同As污染下蜈蚣草根際土、根及莖葉As吸收差異Figure 1 As concentration in rhizosphere, roots and stems of Pteris vittata L.contaminated with different concentration of As

2.2 微生物群落分析

2.2.1 α多樣性和β多樣性指數

蜈蚣草根際及內生微生物群落α多樣性具有顯著差異。如圖2所示，Observed指數和Chao1指數在蜈蚣草根際土樣品中最高，其次是根，最后是莖葉，這表明蜈蚣草根際土中微生物群落最豐富，莖葉中微生物群落豐富度最低。同樣，蜈蚣草根際土Shannon指數和Simpson指數也最高，其次是根，最后是莖葉，說明蜈蚣草根際土中微生物群落均勻度也最高，最低是莖葉。蜈蚣草根際、根和莖葉微生物群落β多樣性分析表明（圖3），蜈蚣草根際及內生微生物群落結構間差異很大，而相比蜈蚣草根內及莖葉內微生物群落結構，蜈蚣草根際微生物群落結構隨砷添加量提高而差異增大，說明砷添加量變化對蜈蚣草根際微生物群落的影響大于其對蜈蚣草根和莖葉內微生物群落的影響。

圖2 蜈蚣草根際土、根及莖葉的α多樣性指數Figure 2 α diversity metrics in rhizosphere, roots and stems of Pteris vittata L.

圖3 蜈蚣草根際土、根和莖葉的微生物群落β多樣性分析Figure 3 β diversity analysis of microbial community in rhizosphere, roots and stems of Pteris vittata L.

2.2.2 微生物群落相對豐度

基于 Illumina Miseq測序和數據分析得到了13742個可操作分類單元（OTU）。蜈蚣草根際土、根及莖葉樣品中 OTU數量具有顯著差異，表現為蜈蚣草根際土（11790個）高于根（3077個）和莖葉（258個）。盡管砷添加量處理不同中，但變形菌門（Proteobacteria）（4007個）在3個不同部位中均占主導地位（圖 4），其在根際土樣品中占47.61%—63.4%，在根樣品中占30.5%—67.6%，在莖葉樣品中占 12.4%—93.3%。其次是放線菌門（Actinobacteriota）（2342個）。此外，基于在屬水平上不同砷添加量處理的不同部位樣品中微生物種群相對豐度統計結果（圖 5）發現，在根際土中相對豐度前 5的菌屬分別是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Pseudolabrys、KD4_96、德沃斯氏菌屬（Devosia）；在根部位中，細菌相對豐度前 5的是鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤桿菌屬（Rhizobacter）、Niastella、根瘤菌屬（Rhizobium）、嗜酸鐵還原桿菌屬（Acidibacter）；在蜈蚣草莖葉中相對豐度前5的菌屬為Xylariaceae、寡營養單胞菌（Stenotrophomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、短桿菌屬（Brevibacterium）、Brechybacterium。

圖4 門水平上蜈蚣草所有樣品中微生物群落相對豐度位列前7的細菌Figure 4 Relative abundances of the top 7 most-abundant phylum within the microbial communities in all samples of Pteris vittata L.

圖5 屬水平上蜈蚣草根際土、根及莖葉中微生物群落相對豐度各位列前5的細菌Figure 5 Relative abundances of the top 5 most-abundant genera within the microbial communities in rhizosphere,roots and stems of Pteris vittata L.respectively

2.3 核心微生物

為了進一步探討蜈蚣草根際、根內和莖葉中對砷響應最重要的微生物，本研究進行了核心微生物分析（圖6）。結果表明，蜈蚣草根際土中核心微生物主要包括黃色桿菌科未確定菌屬（Xanthobacteraceaeuncultured）（圖6a），在蜈蚣草根際土所有樣品中占 2%，以及 KD4-96和（Vicinamibacteralesuncultured），在蜈蚣草90%的樣品中占到2%，其中黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）屬于根瘤菌目。此外，根瘤菌目的根瘤菌屬（Rhizobium）和德沃斯氏菌屬（Devosia）以及屬于噬纖維菌目（Cytophagales）的Ohtaekwangia均在蜈蚣草根所有樣品中占到接近約 2%，可被視為蜈蚣草根的核心微生物（圖 6b）。寡營養單胞細菌屬（Stenotrophomonas）在蜈蚣草80%的莖葉樣品中占10%，是蜈蚣草莖葉核心微生物（圖6c）。

圖6 蜈蚣草根際土、根和莖葉中核心微生物群落（屬水平）Figure 6 The core microbial community in the rhizosphere, roots and stems of Pteris vittata L.

2.4 微生物與砷添加量相關性分析

蜈蚣草根際及內生微生物群落受砷添加量的影響。本研究采用Pearson方法計算出蜈蚣草根際土、根及莖葉中在屬水平上相對豐度位列前9的菌屬與砷添加量的相關性（圖7）。蜈蚣草根際土相對豐度位列前 9的細菌中，67_14、德沃斯氏菌屬（Devosia）、MND1、SC_I_84、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）受砷添加量提高影響較大（P>0.6），其中德沃斯氏菌屬（Devosia）和 MND1與砷添加量大小呈正相關，其他則為負相關。蜈蚣草根際中微生物相對豐度位列前9的菌屬中受砷添加量影響較大的菌屬主要是嗜酸鐵還原桿菌屬（Acidibacter）、Niastella和根瘤桿菌屬（Rhizobacter），且均呈正相關關系。在蜈蚣草莖葉中，Actinospica、分支桿菌屬（Mycobacterium）、Myroides、Stenotrophomonas這 4種菌受砷添加量提高的影響較大（P>0.6），但與砷添加量大小呈正相關的細菌只有寡營養單胞細菌屬，表明砷添加量升高會促進對砷抗性微生物的特定選擇。

圖7 屬水平上蜈蚣草根際土、根和莖葉樣品中相對豐度位列前9的微生物與砷之間的相關性Figure 7 The correlation between microorganisms of the top 9 most-abundant genera and arsenic in the rhizosphere,roots, and stems of Pteris vittata L.

3 討論

3.1 砷在蜈蚣草根際土、根及莖葉中的富集情況

蜈蚣草內生微生物對砷在蜈蚣草體內的累積起了關鍵作用。大量研究表明，在非超累積植物中，根對砷的吸收遠遠超過莖葉（張田等，2020）。在本研究中，蜈蚣草地上部分總砷含量顯著高于蜈蚣草地下部分（根和根際土），這與韓永和等（2017）的研究結果一致。土壤中砷主要以無機態形式被植物吸收，而無機態的兩種存在形式As(Ⅴ)和As(Ⅲ) 進入植物的通道不盡相同，它們分別通過磷酸轉運蛋白和水通道蛋白進入植物根內（陳焱山等，2018）。植物根內As(Ⅴ) 通過微生物迅速被還原為As(Ⅲ)，As(III) 可通過木質部導管介導的長距離運輸到達地上部分（汪京超等，2015），這說明在蜈蚣草的根部可能富集了大量砷還原及砷抗性微生物群落。Gao et al.（2021）研究發現，與致病菌相比，患病植物根和莖會富集更多潛在有益細菌。由此可見，蜈蚣草內生微生物對砷在蜈蚣草的累積發揮關鍵作用。

3.2 微生物群落多樣性

蜈蚣草根際、根內和莖葉內微生物群落多樣性受砷污染情況影響。研究發現，隨砷添加量升高，相較于蜈蚣草的根和莖葉，其根際土微生物群落Observed指數和Chao1指數增大，這可能是由于土壤中砷脅迫作用增強促使蜈蚣草根部分泌根際分泌物，如碳水化合物、氨基酸類和胺類碳源等，從而使根際抗性微生物得到富集（韓永和等，2017）。Nihorimbere et al.（2011）發現根系分泌物的組成和模式影響微生物活性和種群數量，植物種類、植物發育階段和土壤類型被認為是決定根際微生物的主要因素（Broeckling et al.，2008）。此外，莖葉內微生物群落α多樣性指數隨著土壤砷添加量的升高而降低，這可能是因為蜈蚣草莖葉內超累積土壤中的砷所造成的，高添加量砷特異性選擇了莖葉中具有砷抗性的微生物種群（Xiong et al.，2010），而β多樣性表明砷添加量變化對蜈蚣草根際微生物群落的影響大于其對蜈蚣草根和莖葉內微生物群落的影響，這可能是由于土壤砷含量升高，砷脅迫作用增大，直接導致土壤中對砷敏感的微生物死亡或減緩生長，而具有砷抗性能力或砷代謝能力的微生物富集（Turpeinen et al.，1999）。

3.3 微生物群落對蜈蚣草抗砷的潛在貢獻

蜈蚣草根際、根內和莖葉內微生物為蜈蚣草的定殖和砷富集起到重要作用。蜈蚣草對砷的累積主要涉及砷的吸收、砷的還原、砷的區隔化以及砷的運輸4個機制作用，蜈蚣草內生微生物對砷的代謝過程也具有不可忽視的貢獻（Han et al.，2017b）。本研究發現，Alphaproteobacteria菌門微生物在不同砷含量處理中均占主導地位，可能對砷在蜈蚣草內累積起到關鍵作用。Han et al.（2016）在高砷污染場地分離出多種砷還原菌，其均屬于變形菌門，包括假單胞菌和不動桿菌（Acinetobacter）等，且均具有砷還原能力，表明蜈蚣草可選擇性地富集砷還原菌（如 Alphaproteobacteria菌門微生物），實現將As(Ⅴ) 還原成As(Ⅲ)，將蜈蚣草根內的砷大量轉運至莖葉，并保存到液泡中，達到砷超累積效能。此外，蜈蚣草根際土核心微生物種群包括Xanthobacteraceae未確定菌屬屬于根瘤菌目，其在調節根-根內微生物群落-生物之間的相互作用過程中可能發揮重要作用。Ahmad et al.（2020）報道發現在Xanthobacteraceae的一些家族菌群攜帶編碼As(Ⅲ) 氧化酶的aioA基因，具有將As(Ⅲ) 氧化為毒性更低的 As(Ⅴ) 的能力，具有降低砷對蜈蚣草毒害效應的潛能，使得蜈蚣草能夠更好地定植于高砷污染環境中。

Devosia、Rhizobium和Ohtaekwangia是蜈蚣草根內核心微生物。其中，Rhizobium與植物之間的共生固氮作用，除對寄生植物具有固氮作用和提供植物必要的營養元素外，還可通過植物修復受重金屬污染的土壤（Mahieu et al.，2011）。Ghnaya et al.（2015）研究發現，接種根瘤菌的苜蓿植物（MedicagosativaL.）可促進根部對重金屬鎘的吸收，并加強鎘向地上部分轉運的能力，從而達到修復場地鎘污染。同樣，Deepika et al.（2016）研究指出根瘤菌對砷具有很強的抗性，在土壤砷的生物地球化學過程中發揮重要作用。由此可見，根瘤菌對蜈蚣草超富集砷及其內生微生物對砷產生高抗性起著至關重要的作用。此外，Chhetri et al.（2022）研究報道Devosia在L-色氨酸存在下可產生鐵載體和吲哚乙酸（IAA），促進植物生長。Ohtaekwangia是蜈蚣草根內微生物群落另一種核心微生物種群，雖然目前對Ohtaekwangia功能的報道知之甚少，但據報道Ohtaekwangia顯著富集于淹水處理和交替淹水處理的水稻根際土中，且在淹水處理和交替淹水處理的水稻根際土中總砷含量減少（Das et al.，2016）。As(Ⅲ) 的遷移流動性相較于 As(Ⅴ) 更強（Dixit et al.，2003），說明Ohtaekwangia可能具有砷還原能力，導致根際土中的 As(Ⅴ)被還原成As(Ⅲ)，進而被水稻吸收，降低根際土中的砷含量。Stenotrophomonas是蜈蚣草莖葉微生物群落中的核心微生物，Drewniak et al.（2015）在富含砷的巖石生物膜中分離出Stenotrophomonas，表明其對砷酸鹽具有高度耐受性。同樣，在Naidu et al.（2012）的研究中，第一次證明Stenotrophomonas是一株很強的亞砷酸鹽氧化細菌，可在 12 h完全氧化 500 μmol·L-1亞砷酸鹽生成砷酸鹽。同時，基于相關性分析發現，Stenotrophomonas與砷含量呈現正相關關系，表明Stenotrophomonas可能在蜈蚣莖葉內調控著由根部轉運上來的 As(Ⅲ) 轉化為低毒性的As(Ⅴ)，使其能在高砷環境中生存繁殖，同時也降低As對蜈蚣草植株的毒害，促進植物生長。

4 結論

（1）在 250 mg·kg-1和 500 mg·kg-1土壤 As污染下，蜈蚣草莖葉As的富集量遠高于根的As富集量，且蜈蚣草的莖葉As富集系數分別為99.99和66.83。

（2）蜈蚣草根際土、根和莖葉之間的微生物群落多樣性具有顯著差異。

（3）在蜈蚣草根際土、根和莖葉內，均有砷抗性微生物大量富集。并且，與砷添加量呈正相關的優勢菌群均可被富集在在蜈蚣草根際土、根和莖葉內，如在根際土中有德沃斯氏菌屬（Devosia）和MND1；在根內有嗜酸鐵還原桿菌屬（Acidibacter）、Niastella和根瘤桿菌屬（Rhizobacter）；寡營養單胞細菌屬（Stenotrophomonas）在莖葉中富集。