酸制劑及其衍生物對育肥豬腸道微生物多樣性的影響研究

李 寧，于海霞，劉仲昊，鄭 梓，閆 峻，王鴻英

（1.天津市農業科學院畜牧獸醫研究所，天津 300380；2.天津市農業發展服務中心，天津 300061）

酸制劑已經從簡單的防腐劑逐漸轉變為飼料的促生長添加劑和重要的抗生素替代產品。在替代抗生素的大背景下，各種酸在飼料中的應用更加凸顯。自2006年歐盟禁止抗生素添加劑以來，酸制劑便成為豬飼料中常見的抗生素替代物之一，主要應用于斷奶仔豬、妊娠和哺乳期母豬，用來改善生長性能和飼料報酬。酸制劑的主要作用方式是通過調節胃腸道微生物，維護腸道黏膜形態，提高酶活性和增強動物能量代謝來實現的。進入胃腸道后，酸制劑解離提供質子，能夠穩定斷奶仔豬胃中的pH值，阻礙胃腸道中病原微生物的定殖生長，激活胃蛋白酶原，提高仔豬的消化能力；未解離的酸穿過病原微生物的細胞膜并作用于膜上的酶和細胞質內功能分子，起到抑菌殺菌的作用；部分酸制劑還能夠作為上皮黏膜細胞的能量底物參與三羧酸循環。現有酸制劑主要包括有機酸、無機酸、脂肪酸、酸鹽和復合酸。常見的酸制劑有甲酸、乳酸、富馬酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、綠原酸、酒石酸、苯甲酸等。前人研究中多使用單一酸制劑的方式開展相關研究，且在生豬生產應用中主要集中在仔豬階段，本研究以多種酸制劑組合的方式，探究不同酸制劑組合對育肥豬腸道微生物結構的影響，以期為解決育肥豬出欄前減少抗生素使用的同時保證豬群健康的飼養管理瓶頸問題提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 選擇日齡相近、健康狀況良好、體重相近（93.00±2.00 kg）的杜×長×大三元雜交閹公豬48頭。

1.1.2 酸制劑及其衍生物 短鏈與中鏈復合酸制劑（甲酸≥23.9%，乳酸≥14.5，檸檬酸≥4.0，月桂酸≥8.6）；酸制劑衍生物（單月桂酸甘油酯≥80%）；短鏈復合酸制劑（檸檬酸≥10%，富馬酸≥30%，蘋果酸≥10%）。

1.2 試驗設計

將48頭育肥豬隨機分為4組，每組3個重復，每個重復4頭豬。A組飼喂基礎飼糧（玉米—豆粕型飼糧），B組在A組飼糧中添加1 kg·t短鏈與中鏈復合酸制劑，C組在A組飼糧中添加1 kg·t酸制劑衍生物，D組在A組飼糧中添加1 kg·t短鏈復合酸制劑。

基礎飼糧按照NRC（2012）豬營養需要中75～100 kg階段豬的營養需要配制顆粒飼料，飼料組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）

1.3 飼養管理

試驗地點為天津市農業科學院示范創新基地，基地采取嚴格的生物安全防護措施，試驗豬自由采食、飲水。預飼期5 d，試驗期45 d。

1.4 腸道微生物的測定及采樣方法

試驗第40天，采集育肥豬新鮮糞便，裝入無菌凍存管，立即投入液氮中，每組采集4個樣品，樣品采集完畢后送北京百邁客生物科技有限公司使用illumina novaseq 6000進行上機測序。

1.5 數據整理及分析

試驗數據使用SPSS 22.0軟件進行ANOVA分析，用Duncan法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。數據以平均值±標準差形式表示。

2 結果與分析

2.1 育肥豬糞便微生物測序有效性結果分析

稀釋性曲線被用來判斷樣品測序量是否足夠反應該樣中物種的情況，當其在一定范圍內曲線趨于平緩，表示樣本測序量充足，能夠有效反映該樣本的微生物含量，反之則不能。由圖1可知，A、B、C和D組曲線均趨于水平，表明各組的測序量已經充足，能夠代表該樣本進行物種豐度多樣性分析。

圖1 稀釋性曲線

2.2 育肥豬糞便微生物分類操作單元（OTU）分析

分類操作單元（OTU）是將相似度在97.0%以上的序列進行聚類得到的單元。由圖2可知，與A組相比，B組有1個特有OTU，C組有1個特有OTU，D組有1個特有OTU，4組共有的OTUs為696個。

圖2 育肥豬糞便微生物OTUs Venn圖

2.3 育肥豬糞便微生物分類學分析

在門水平上，各組物種所占相對豐度比例前15如圖3所示，占比超過20%的物種有擬桿菌門（Bacteroidetes），厚壁菌門（Firmicutes），螺旋體門（Spirochaetes）；占比超過0.5%的物種有變形菌門（Proteobacteria），A、B組的纖維桿菌門（Fibrobaeteres），Kiritimatiellaeota，A、D組的Tenerieutes；占比超過0.1%的物種有放線桿菌門（Actinobactena），Uncultured_bacterium_k_Bacteria，A、B、D組的藍藻（Cyanobacteria）和B組的髕骨細菌門（Patescibacteria），ε-桿菌菌門（Epsilonbacteraeota）；前15種菌種的其余物種協生菌門（Synergistetes），疣狀菌門（Verrucomicrobia），豆狀芽胞（Lentisphaerae）所占相對比例均小于0.1%。以上15種物種占樣品糞便微生物總數95%以上。

圖3 育肥豬糞便微生物門水平種類分析

由表2可知，B組的Bacteroidetes顯著高于其他組（P<0.05），D組的Firmicutes顯著高于對照組，Kiritimatiellaeota顯著低于對照組，Verrucomicrobia顯著低于對照組（P<0.05）。

表2 育肥豬糞便微生物門水平種類分析 %

在屬水平上，各組物種所占相對豐度比例前15如圖4所示，相對占比超過10%的為Treponema_2；占比超過5%的為Rikenellaceae_RC9_gut_group、A、B組的uncultured_bacterium_f_Prevotellaceae、B組的uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae；其余Prevote llaceae_NK3B31_group、Ruminococcaceae_UCG-005、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Prevotellac eae_UCG-001、uncultured_bacterium_f_p_2534_18B5_gut_group、Ruminococcaceae_UCG-002、Streptococcus、uncultured_bacterium_f_F-082、Prevot-ellaceae_UCG-003、Lactobacillus、dgA_11_gut_group占比均超過1%。

圖4 育肥豬糞便微生物屬水平種類分析

由表3可知，B組的Treponema_2顯著低于A和C組（P<0.05），B組的uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae、dgA_11_gut_group顯著高于其他組（P<0.05），D組的Ruminococcaceae_UCG-005、Streptococcu顯著高于A、B組（P<0.05），C組的Prevotellaceae_UCG-001顯著高于其他組（P<0.05），C組的uncultured_bacterium_f_p_2534_18B5_gut_group顯著低于其他組（P<0.05），A組 的Lactobacillus顯著低于其他組（P<0.05）。

表3 育肥豬糞便微生物屬水平種類分析 %

2.4 育肥豬糞便微生物α多樣性分析

微生物豐度及多樣性常用Alpha多樣性來表示，Ace、Chao1、Simpson、Shannon是用來展示多樣性和豐度常用的指標。Chao1和Ace指數能夠反映物種數量的多少，Simpson和Shannon指數用于反映物種種類的多少。如表4所示，A、B組的Ace、Chao1和Shannon指數均顯著高于C組和D組（P＜0.05），A組和B組之間、C組和D組之間差異不顯著；B組和D組的Simpson指數高于A組和C組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 育肥豬糞便微生物α多樣性分析

2.5 育肥豬糞便微生物β多樣性分析

非加權組平均法（UPGMA）的結果樣品聚類樹中各組樣品靠近程度與樣品微生物組成相似度成正比。如圖5所示，在屬水平上，A、B和D組均能夠較好的單獨聚類，表明不同酸制劑及其衍生物影響育肥豬直腸糞便中微生物的組成。

圖5 UPGMA聚類分析

非度量多維標定法（NMDS）中相同顏色的點代表來自同組，當2個相同顏色的點距離越近，表明這2個樣本微生物種類越相似。如圖6所示，各試驗組腸道微生物群落聚類良好，且無較大交叉，表明A、B、C、D組微生物群落差異較大，表明不同酸制劑對育肥豬糞便微生物群落結構有一定的影響。

圖6 育肥豬糞便微生物NMDS分析

2.6 育肥豬糞便微生物LEfSe分析

LEfSe用來判定不同組之間差異性顯著的菌群。進化分支圖相同顏色表示組間物種無顯著性差異，不同顏色表示2組之間該點的物種有顯著性差異，原點的大小表示物種豐度。由圖7可知，B組和D組之間部分物種有顯著性差異，B組為:s_uncultured_bacterium_g_dgA_11_gut_group、g_dgA_11_gut_group、f_Rikenellaceae、o_Bacteroidales、s_uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和g_uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae；D組分別為s_uncultured_bacterium_g_Lactobacillus、g_Lactobacillus、f_Lactobacillaceae、s_uncultured_bacterium_g_Streptococcus、g_Streptococcus、f_Streptococcaceae、o_Lactobacillales。

圖7 LEfSe分析進化分支圖

2.7 育肥豬糞便微生物PICRUSt2功能預測

如圖8所示，KEGG功能預測分析顯示，與A組相比，B組微生物的氟苯甲酸降解（Fluorobenzoae degradation）、硫 酸 代 謝（sulur metabolism）、類胡蘿卜素生物合成（carotenoid biosynthesis）、甲苯降解（toluene degradation）、腎細胞癌（renal cell carcinoma）、光合生物中的碳固定（carbon fixation in photosynthetic organisms）、檸檬烯和蒎烯降解（limonene and pinene degradation）能力顯著升高；C組的金黃色葡萄球菌感染（staphylococcus aureus infection）顯著增加；C組、D組的類固醇降解（steroid degradation）、二苯乙烯類二芳基庚烷和姜辣素生物合成（stilbenoid diarylheptanoid and gingerol biosynthesis）、初級膽汁酸生物合成（primary bile acid biosynthesis）能力均顯著下降。

圖8 KEGG組間代謝途徑差異分析

3 結論與討論

長期以來，抗生素被視為致病菌的克星，在養殖行業被大規模應用。部分抗生素主要是通過破壞致病菌細胞完整性，阻斷致病菌繁殖而實現抗菌的目的。動物攝入抗生素后通過抑制體內致病微生物繁殖，調節機體健康，提高生長性能。

短鏈脂肪酸不能由動物自身合成，主要由動物攝入的飼料和腸道內微生物代謝產生，如腸道中的乙酸，主要是寄生在動物腸道中的雙歧桿菌、乳桿菌、普雷沃斯菌的代謝產物，丙酸由擬桿菌屬和厚壁菌屬產生，丁酸由厚壁菌門產生。有研究表明,丁酸鹽在腸道中能夠為細胞供能，降低壞死性腸炎對腸道的破壞，保護腸道結構的完整程度，次功能是丁酸通過上調Claudin-3的RNA和蛋白表達水平維持緊密連接蛋白的濃度，還能夠降低IL-6和NF-κB的表達，增加緊密連接蛋白Claudin-7的表達。Xiang等研究發現，由甲酸（31%）、甲酸銨（23%）、乙酸（8.3%）組成的復合酸制劑1以及甲酸（13%）、甲酸銨（19%）、乙酸（10%）、丙酸（13%）、山梨酸（0.5%）、乳酸（1%）和檸檬酸（0.5%）復合酸制劑2均能夠影響仔豬盲腸細菌Blautia、Bulleidia、Coprococcus、Dorea、Eubacterium、Subdoligranulum和YRC2的豐度。

有機酸是動植物組織的組成成分，飼用有機酸常見的有富馬酸、蘋果酸、琥珀酸等，大多數學者認為，有機酸發揮功能主要是通過增加腸道中H濃度，影響了如大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌群的寄生環境，同時為乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌群的生存提供有利條件，保證腸道內微生物菌群的穩態，防止和降低微生物性腸炎的發生。Muniyappan等在評估微囊化有機酸混合物對育肥豬糞便微生物的影響中表示，基礎飼糧中添加0.05%和0.1%的有機酸能夠顯著降低豬糞便中大腸桿菌的數量。有研究表明，飼糧中添加0.1%，0.2%，0.5%檸檬酸，能夠抑制肉雞十二指腸、盲腸中的大腸桿菌生長,促進乳酸桿菌增殖。有研究顯示，斷奶仔豬飼料中單獨添加1.5%的檸檬酸后，對仔豬胃、空腸、盲腸以及結腸末端的厭氧菌、乳酸桿菌、梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌的豐度無顯著影響。Ma等在研究復合酸制劑（甲酸11%、甲酸銨13%、丙酸10%、乙酸5.1%和檸檬酸3.7%）對斷奶仔豬腸道健康的影響時發現，飼糧中添加5 g·kg復合酸制劑后，仔豬盲腸中乳酸桿菌含量顯著增加，志賀菌的豐度有下降趨勢。同樣，Wei等在探究苯甲酸中添加酸制劑衍生物（乙酸酯）的研究中發現，飼糧中添加0.5%苯甲酸和0.105%乙酸酯試驗豬腸道中的微生物種類多樣性高于對照組，但是多樣性會在第21天時消失；在整個試驗過程中，飼糧中添加0.5%苯甲酸和0.035%乙酸酯試驗豬腸道的微生物多樣性顯著高于其他組。本研究結果顯示，飼糧中添加1 kg·t短鏈與中鏈復合脂肪酸后，豬腸道擬桿菌門顯著高于其他組。添加1 kg·t短鏈復合酸制劑的豬腸道中厚壁菌門顯著高于對照組、疣菌門顯著低于對照組。飼糧中添加1 kg·t的短鏈與中鏈復合脂肪酸能夠提高腸道微生物種類和種群數量，腸道微生物多樣性增加。以上結果均與本研究中酸制劑能夠改善仔豬腸道微生物豐度和多樣性的結果相近。

中鏈脂肪酸是一種有效的微生物抑制劑，它能夠較強的抑制多種病原微生物，如革蘭氏菌、包膜病毒、藻類、真菌、原生動物等。其抗微生物的作用機制已經在多方試驗進行過研究，明確其主要機制是由于中鏈脂肪酸具有兩親性，能夠導致細胞膜失去穩態，影響包膜孔隙形成的一系列生化反應。中鏈脂肪酸通過競爭電子載體或者破壞膜完整性，破壞了電子傳遞的過程，并能夠使膜電位失衡進而干擾氧化磷酸化。此外，有研究稱，脂肪酸還能夠抑制葡萄糖基轉移酶的活性，該酶是膜攝取養分的關鍵活性酶。有調查研究表明，癸酸（C10）和月桂酸（C12）是脂肪酸中表現效果最好的脂肪酸，而其單甘油酯通常能夠增加脂肪酸的活性，它們能夠在膠束狀態下破壞細胞膜的磷脂層。但是，不同的中鏈脂肪酸往往對不同的微生物起到抑制作用，如單月桂酸甘油酯、月桂酸（C12）以及辛酸（C8）和癸酸（C10）的混合物能夠對諸如大腸桿菌、豬鏈球菌、浦那沙門氏菌和產氣莢膜梭狀芽孢桿菌等致病微生物表現出強大的抑制效果。同樣，有研究顯示，月桂酸單甘油酯對炭疽芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌具有殺滅效果，還能夠抑制污染豬場飼料源頭的重要致病菌（李斯特菌）的增殖。有研究表明，飼料中添加脂肪酸后，脂肪酸通過影響腸道微生物的α多樣性和β多樣性，從而維持腸道穩態或提高腸道健康狀況。Devkota等[研究發現，飼料中添加飽和脂肪酸（如辛酸、癸酸和月桂酸等），可影響亞硫酸鹽還原性致病菌（沃氏嗜膽菌）的繁殖。本研究發現，飼糧中添加短鏈與中鏈復合酸制劑后，Treponema_2顯著降低，uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae、dgA_11_gut_group顯著增加，結果與前人研究相近。

育肥豬飼糧中添加酸制劑后，改善了育肥豬微生物群落結構，腸道中有益菌的相對豐度提高，有害菌的相對豐度降低，同時促進了腸道微生物的代謝功能。