食品中瘦肉精常用檢測方法及快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展

劉穎沙， 李艷莉， 雷 瓊， 吝瑞花， 徐妍妍， 魯 瑤， 岳彩洋

（1. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2. 楊凌質(zhì)量技術(shù)檢測檢驗(yàn)所，陜西 楊凌 712100）

0 引言

瘦肉精是β 腎上腺受體激動(dòng)劑類化合物的統(tǒng)稱，包括鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等10 余種物質(zhì)，這種藥物能加速畜禽體內(nèi)的瘦肉生長，同時(shí)也能對畜禽體內(nèi)的肥肉生長進(jìn)行抑制[1]。最初在動(dòng)物喂養(yǎng)過程中，以超出10 倍規(guī)定劑量將瘦肉精應(yīng)用到畜禽飼料，因?yàn)槭萑饩挠昧亢艽螅倚笄荽x慢，會(huì)在畜產(chǎn)品中造成大量的藥物殘留，如果人們食用含有瘦肉精殘留的畜產(chǎn)品，會(huì)出現(xiàn)中毒情況[2]。近些年，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等部門頒布制定各項(xiàng)規(guī)章，禁止使用抗生素、促生長激素及一些化學(xué)合成物，也發(fā)布若干項(xiàng)關(guān)于獸藥殘留的監(jiān)控計(jì)劃，很多省市地方均建立了豬肉安全體系，規(guī)定活體的豬只有尿檢合格后才可以進(jìn)行屠宰，也在各個(gè)地方建立產(chǎn)地檢疫和屠宰檢疫，確保消費(fèi)者舌尖上肉制品的安全[3]。在現(xiàn)有政策和法規(guī)的約束下，仍然存在部分養(yǎng)殖人員未遵守相關(guān)規(guī)定，為得到更多瘦肉獲取更大利潤，繼續(xù)使用瘦肉精；也有一些企業(yè)采用私下手段，非法使用鹽酸克倫特羅等藥品，以牟取暴利，威脅消費(fèi)者的身體和生命安全[3]。市面上關(guān)于瘦肉精的檢測方法琳瑯滿目，本文就現(xiàn)有瘦肉精的檢測方法進(jìn)行比較研究，重點(diǎn)綜述感官檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法的優(yōu)劣，分析在國家越來越重視快速檢測的大背景下涌現(xiàn)的瘦肉精快速檢測方法，介紹常見瘦肉精快速檢測卡優(yōu)化和改進(jìn)措施，為后續(xù)繼續(xù)不斷深入研發(fā)新型快速檢測技術(shù)提供依據(jù)，確保消費(fèi)者舌尖上肉制品的安全，推動(dòng)肉類食品加工行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 現(xiàn)有瘦肉精檢測方法

1.1 感官檢測法

感官檢測法是通過肉眼最直接判定的方法，觀察肉的顏色，一般含有瘦肉精的豬屠宰后肉色鮮紅，后臀肌肉飽滿突出，脂肪厚度較薄，一般小于1 cm，而健康肉的肉色一般都呈現(xiàn)淡紅色，肉的彈性較好[4]。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是利用酶標(biāo)記抗原或抗體以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。由于抗原抗體結(jié)合具有特異性，ELISA 法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、通量大及檢測效率高等優(yōu)點(diǎn)。酶標(biāo)板上包被的抗原會(huì)與樣品中的抗原共同競爭酶標(biāo)抗體，在試驗(yàn)過程中加入底物，通過顯色反應(yīng)，酶標(biāo)孔中會(huì)有顏色的變化，最后加入終止液在15 min 內(nèi)終止反應(yīng)，依據(jù)顏色變化定性判定，通過酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)進(jìn)行定量判定。由于ELISA 的原理特異性，在建立方法過程中使用的抗原、抗體都具備較強(qiáng)活性，結(jié)果容易受到酶的影響，對溫度及孵育條件具有較高的要求，再加上ELISA 法全程使用移液槍，對操作者技術(shù)操作要求較高，稍微不熟練或者使用不規(guī)范就會(huì)造成結(jié)果不準(zhǔn)確，容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象[5]。CONG Yang 等[6]以小鼠抗體建立OSELISA 反應(yīng)試驗(yàn)，將克倫特羅與牛血清白蛋白結(jié)合來對小鼠進(jìn)行免疫，得到抗體庫，對抗體進(jìn)行分離和篩選，檢測限為8 ng/mL。很多科研工作者對現(xiàn)有ELISA方法不斷改進(jìn)，制備單克隆抗體，通過優(yōu)化免疫技術(shù)，分離和篩選得到特異抗體，改善假陽性現(xiàn)象，提高了精確度和靈敏度，但是目前ELISA 法還是適用于大批量樣品的初篩。

1.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）因其具有準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，是我國規(guī)定的克倫特羅殘留的半確證性檢測的方法之一，其對于豬尿和豬肉前處理方式不同，豬尿可直接上機(jī)檢測，豬肉需要先制成勻漿，然后進(jìn)行萃取、洗脫等操作，上機(jī)測定后，通過外標(biāo)法進(jìn)行定量[2]。HPLC 檢測準(zhǔn)確度高、精確度高及假陽性低，是較可靠的瘦肉精檢測方法，整個(gè)檢測過程只需要4 h 即可，對于幾乎所有的豬肉制品都可以采用高效液相色譜法，此法可以與質(zhì)譜等系統(tǒng)聯(lián)用，結(jié)果更加準(zhǔn)確[7-8]。劉纓等[9]利用固相萃取?液質(zhì)聯(lián)用法，以多壁碳納米管及其改性材料為吸附劑，建立新型識別檢測法。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，這種方法不僅節(jié)約時(shí)間、方便，而且準(zhǔn)確度高，以加標(biāo)進(jìn)行基質(zhì)干擾試驗(yàn)，回收率87.5%～97.8%，比較適合豬尿液的前處理。程江闖等[10]建立了QuEChERS-超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法，在10 min 內(nèi)完成分離分析，在0.5、1.0 和5.0 μg/kg 添加水平的回收率為62.4%～116.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差位1.1%～20.0%，檢出限為0.5 μg/kg，完成牛羊肉中36 種瘦肉精殘留量的測定。劉迪等[11]建立一種超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法，克倫特羅的檢出限和定量限分別為0.05、0.20 μg/kg，同時(shí)測定豬肉中傳統(tǒng)型和新型“瘦肉精”的分析方法。吳劍平等[12]建立了豬尿中鹽酸賽庚啶殘留量的分散液相微萃取（DLLME）/超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)檢測法，方法的檢出限為0.05 μg/L，具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。孫曉亮等[13]對液相色譜分離條件、MS/MS 檢測參數(shù)及樣品前處理方式進(jìn)行了優(yōu)化，建立超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法，檢出限為0.1 μg/L，定量限為0.3 μg/L。柳海燕等[14]對新型“瘦肉精”賽庚啶及其檢測方法進(jìn)行了探究。李丹妮等[15]建立了QuEChERS 前處理結(jié)合超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測豬組織中賽庚啶和可樂定殘留量的方法，方法檢出限為0.5 μg/kg。科研工作者通過對高效液相色譜法檢測瘦肉精的前處理、檢測參數(shù)和分離條件優(yōu)化，提高檢測速率，從而使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確和靈敏。

2 現(xiàn)場快速檢測方法必要性

我國與歐美在食品入市方面的做法比較（圖1）發(fā)現(xiàn)，歐美等發(fā)達(dá)國家在食品入市方面的做法是采樣后進(jìn)行快速檢測，快速檢測達(dá)標(biāo)的產(chǎn)品可直接上市，未達(dá)標(biāo)的樣品需要進(jìn)行進(jìn)一步檢測，若達(dá)標(biāo)可直接上市，若不達(dá)標(biāo)禁止上市并做召回處理，如圖1b 所示。我國與歐美國家相比，在快速檢測方面未廣泛應(yīng)用。近些年，我國食品安全朝著向好的方向發(fā)展，但是仍發(fā)生一些食品安全事故[16]。國家越來越重視快速檢測在食品安全檢測方面的應(yīng)用，尤其是快速檢測設(shè)備越來越多，為傳統(tǒng)的簡單通過眼睛、鼻子等方便進(jìn)行篩查提供了技術(shù)支撐和保障。《中華人民共和國食品安全法實(shí)施條例》中規(guī)定質(zhì)量監(jiān)督等部門可以用快速檢測方法對食品進(jìn)行初步篩查。

圖1 我國與歐美等發(fā)達(dá)國家在食品入市方面的做法比較Fig. 1 Comparison of food market entry practices between China and developed countries such as Europe and the United States

對于瘦肉精的快速檢測，指在短時(shí)間（理化檢測時(shí)間<2 h，酶聯(lián)免疫檢測時(shí)間<4 h）出具檢測結(jié)果的過程。現(xiàn)在市面上最常用的現(xiàn)場瘦肉精快速檢測通過現(xiàn)場采樣，利用快速檢測膠體金試紙條進(jìn)行樣品檢測，得出陰陽性判定結(jié)果。通過現(xiàn)場檢測，可以有效提高檢測效率，對于初篩不合格的樣品或可疑樣品進(jìn)行二次檢測，二次檢測的樣品量明顯大大降低，這樣既可以提高監(jiān)督效率，擴(kuò)大檢測覆蓋面，也可以降低實(shí)驗(yàn)室的檢測費(fèi)用，減少實(shí)驗(yàn)室工作壓力。

3 現(xiàn)場快速檢測方法

3.1 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

為了快速檢測生鮮肉中的瘦肉精，翟晨等[17]研究利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，以沙丁胺醇為檢測目標(biāo)物，建立了一種快速檢測肌肉組織和肝臟中瘦肉精含量的方法。對肌肉組織和肝臟中沙丁胺醇含量進(jìn)行檢測，檢出限分別為0.01 和0.02 mg/kg，實(shí)現(xiàn)肌肉組織和肝臟中沙丁胺醇含量的定量檢測。

3.2 背景熒光猝滅?免疫層析法

基于背景熒光猝滅?免疫層析法，吳曉霞[18]研制快速檢測豬肉中鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺的定量檢測卡，建立篩選檢測系統(tǒng)，其中可確定T 線抗原濃度和小試杯中抗體標(biāo)記濃度，應(yīng)用最佳檢測系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和樣品測定。與國標(biāo)方法檢測結(jié)果無顯著性差異（p>0.05），特異性強(qiáng)、靈敏度高，將待測物的方法學(xué)結(jié)果儲存于二維碼中，可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確比對。

3.3 便攜式瘦肉精快速檢測箱

基于現(xiàn)有瘦肉精檢測的弊端問題，李洪根[19]研發(fā)成功一款小巧便攜、續(xù)航能力強(qiáng)、溫度較恒定、簡便易操作、耐用不易損的便攜式瘦肉精快速檢測箱，檢測結(jié)果正確率為90%以上，解決低溫條件下瘦肉精快速檢測準(zhǔn)確率低的難題。

3.4 膠體金免疫層析卡

市面上最常見的瘦肉精快速檢測方法即為快速檢測試紙條。此方法利用抗原與抗體的免疫學(xué)反應(yīng)。膠體金對蛋白質(zhì)分子有較強(qiáng)的吸附功能，加上膠體金表面呈負(fù)電性，能夠與表面帶正電荷的蛋白（抗原、抗體）通過靜電作用結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記，形成具備穩(wěn)定性的金標(biāo)抗原或金標(biāo)抗體。對于瘦肉精快速檢測卡，在底板上固定硝酸纖維素膜（NC 膜），在NC 膜的檢測區(qū)（T 線）包被抗原，在質(zhì)控區(qū)（C 線）包被二抗。在NC 膜左上壓住NC 膜0.2 cm 區(qū)域?yàn)榻饦?biāo)墊，在金標(biāo)墊噴涂金標(biāo)抗體，當(dāng)樣品加入后，液體從樣品墊?金標(biāo)墊?NC 膜?吸水墊進(jìn)行層析泳動(dòng)，樣品中的抗原會(huì)和T 線上包被的抗原共同競爭金標(biāo)抗體。若樣品中含有瘦肉精，在金標(biāo)墊上會(huì)形成金標(biāo)抗體?樣品抗原，接觸T 線后，不會(huì)出現(xiàn)紅色條帶；若樣品中不含瘦肉精，T 線的抗原會(huì)與金標(biāo)抗體?抗原，出現(xiàn)紅色條帶。C 線是用來判定卡片是否有效，因?yàn)槎嘤嗟慕饦?biāo)抗體會(huì)繼續(xù)泳動(dòng)，與C 線的二抗發(fā)生反應(yīng)，使得C 線顯示區(qū)紅色條帶，故C 線顯色是判定檢測卡是否有效的標(biāo)志。

膠體金免疫層析法檢測結(jié)果方便觀察、成本較低，檢測時(shí)間10～15 min，適合大批量初篩檢測，但是市售的卡片靈敏度為3～5 μg/L，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 933?2005《尿液中鹽酸克侖特羅的測定 膠體金免疫層析法》中對于膠體金免疫法檢測克倫特羅的判定限為3 μg/L，檢測方法略高于標(biāo)準(zhǔn)，所以特異性和靈敏度較低，容易造成結(jié)果的不準(zhǔn)確，出現(xiàn)誤判的可能性大。另外，采用肉眼判讀，當(dāng)檢測線顯色比較模糊時(shí)，可能引起誤判或漏判，檢測結(jié)果難以保存[20]。結(jié)果沒有數(shù)據(jù)顯示且不能與物聯(lián)網(wǎng)相結(jié)合，所測結(jié)果難以進(jìn)入國家食品安全數(shù)據(jù)庫。

隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在市面上對傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改進(jìn)。陳藝宏[21]通過自制的CLB-BSA，對瘦肉精金標(biāo)檢測卡的制備條件及樣品的前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，采用2 μg/mL 抗體最適添加量，14 000 r/min 離心15 min等條件，檢測限可達(dá)到12 ng/g。劉兆金等[22]研發(fā)多通道膠體金讀卡儀軟件V1.0，即可消除肉眼判讀誤差。定量檢測卡的出現(xiàn)打破膠體金卡只能定性的單一性，用小型的膠體金讀數(shù)儀進(jìn)行結(jié)果讀取，定量檢測范圍在0.3 ～10.0 μg/L，提高準(zhǔn)確度和靈敏度。那冠瓊[23]設(shè)計(jì)完成新型“瘦肉精”等獸藥的免疫快速檢測，建立了膠體金試紙條方法定性定量檢測豬肝中沃尼妙林，制備高靈敏度的單克隆抗體并進(jìn)行ic-ELISA 鑒定，達(dá)到裸眼消線值為50 ng/g，讀條儀定量檢測IC50為6.06 μg/L。郭翼等[24]研發(fā)成功利用免疫競爭法的一種基于光學(xué)成像的瘦肉精檢測儀器，儀器具備自動(dòng)檢測、智能計(jì)算和數(shù)據(jù)存儲等優(yōu)點(diǎn)，定量顯色分析儀器已推廣應(yīng)用于其他多項(xiàng)食品安全項(xiàng)目的檢測。柳海燕等[25]研制了用于現(xiàn)場檢測肉制品中鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇（瘦肉精）的二聯(lián)快速檢測試紙條，其檢測靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性都較高。任清丹等[26]對瘦肉精三聯(lián)快速檢測卡的檢測準(zhǔn)確性提出改進(jìn)措施，提供技術(shù)攻關(guān)。喻俊磊等[27]對動(dòng)物源性食品中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇快速檢測產(chǎn)品的穩(wěn)健性評價(jià)，對瘦肉精快檢產(chǎn)品進(jìn)行評價(jià)測試和改進(jìn)。李鵬等[28]研發(fā)新型瘦肉精班布特羅膠體金快速檢測卡和瘦肉精西馬特羅膠體金快速檢測卡，拓寬瘦肉精檢測范圍。

隨著科學(xué)進(jìn)步，目前膠體金檢測卡在實(shí)踐檢驗(yàn)中準(zhǔn)確度和靈敏度有所提高，因其具備被基層推廣及簡單快速的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已應(yīng)用于基層篩選工作。瘦肉精快速檢測的技術(shù)、產(chǎn)品已經(jīng)經(jīng)過國家食藥局批準(zhǔn)認(rèn)可，并在國家獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃的大力支持下廣泛使用，已有30 個(gè)省市，200 多份樣品例行檢測。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國有近萬家的養(yǎng)殖、屠宰、動(dòng)物加工企業(yè)，累計(jì)2 億份樣品需要進(jìn)行日常檢測，據(jù)此數(shù)據(jù)說明瘦肉精快速檢測卡具有廣闊的應(yīng)用市場和前景[29]。

4 結(jié)束語

瘦肉精有促生長、減少脂肪含量、提高瘦肉率等功效，但可對人們健康造成威脅。對于瘦肉精的檢測，消費(fèi)者可采用感官檢測法進(jìn)行日常篩查。對于檢測部門，采用膠體金快速檢測卡進(jìn)行初步篩查，接著用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行初步復(fù)查，進(jìn)而用高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法及生物傳感技術(shù)等實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行定量檢測，提高檢測效率和準(zhǔn)確度。現(xiàn)在市面上最常用的瘦肉精快速檢測方法是利用膠體金試紙條，對于科研工作者，將繼續(xù)不斷深入研發(fā)新型快速檢測技術(shù)，確保消費(fèi)者舌尖上肉制品的安全性，推動(dòng)肉類食品加工行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。