環介導等溫擴增技術LAMP在植物病毒檢測中的研究進展

孟若雪

（貴州省植物保護研究所，貴州 貴陽 550006）

植物在人的生存發展中起著尤為重要的作用。植物可作為食物、觀賞、災害防控等作用，植物的第二大病原是植物病毒，植物病毒每年給重要經濟作物帶來嚴重的損失，全世界每年農作物遭到植物病毒危害造成的損失達200 億美元［1］，對人類的生存和發展構成嚴重威脅。植物病毒病有很多種，對植物的影響不僅包括外觀的損害，還包括植物的質量，在植物病毒病的防控方面人們采取了很多措施，但并不能阻止植物病毒病的快速傳播，所以切斷來源就成了最為重要并且主要的防控措施，生產初期對植物種苗以及種薯進行脫毒處理便成為主要的防控措施。

植物病毒病的識別、診斷及病原鑒定比真菌和細菌病害的鑒定更復雜，傳統植物病毒病一般根據癥狀，發生特征、寄主類型、植物長勢、顯微鏡觀察以及血清學方法進行檢測鑒定，常依靠的是試驗人員的經驗［2］。這些方法存在很多不足，因為很多病毒在引起病害過程中的病癥較相似，寄生在寄主的過程中變化也較快，不能根據簡單的血清學方法鑒定，因此，只依靠傳統的方法進行檢測，不但影響檢測效率，還很難適應多種變化的檢測環境。

隨著分子生物學、生物化學、免疫學的進步，為植物病毒的鑒定監測和量化提供了新的方法。NOTOMI 等［3］于2000年開發了一種新型的核酸擴增方法——環介導等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplifica?tion，LAMP），該方法只需要一臺環介導等溫擴增儀，在等溫條件下可以高效、靈敏、快速、特異地擴增靶序列，且操作簡便，適合各種各樣的檢測環境。該方法廣泛應用于醫學病原物檢測、食品安全檢測、飲用水檢測等方面，近年來，開始應用于植物病原物的檢測，但在應用過程中呈現出一些問題。介紹LAMP方法的原理、特點、植物病毒LAMP檢測的應用進展以及未來的發展趨勢，為植物病毒病的早期預防提供技術支撐，同時也為該技術更好應用于其他領域提供借鑒。

1 LAMP方法原理及特點

1.1 LAMP引物的設計和擴增原理

在LAMP反應中，引物設計較復雜，決定LAMP 方法能否具有高效特異反應的關鍵主要在于引物設計的合理性，只有最佳的引物才能與Bst 聚合酶產生鏈置換反應。設計LAMP 引物的過程主要是針對靶基因的6 個特定區域，通過LAMP引物的設計原理，主要設計4個引物，包括1對外引物和1對內引物。如果想提高引物的特異性并且縮短LAMP反應的時間，還可以在引物組里面添加1對環引物［4-5］，如圖1所示。

圖1 靶基因上6個區域和引物位置（摘自日本榮研株式會社）

Bst DNA 聚合酶適宜的溫度是60～65℃，所以LAMP 反應溫度一般設置為60～65℃，并且是等溫擴增，不同病毒LAMP 反應的溫度可能略有差異。LAMP 反應的第一階段如圖2所示，模板首先與內部引物進行特異性結合，同時，在聚合酶作用下進行有效的擴增反應，特定的序列開始向前延伸，在引發鏈中進行置換反應，替換新的目的序列，然后引入外部引物以形成環結構［6］。第二階段，主要涉及到內部引物的參與，引物和模板進行特異性識別的過程中，模板通過延伸和置換無限的循環作用，在反應結束后，形成大小不同的雙鏈DNA混合物［7-8］。

圖2 LAMP反應原理（摘自日本榮研株式會社）

1.2 LAMP的反應體系

LAMP 反應體系需要在緩沖液、鎂離子、活性酶和引物組的參與下完成。LAMP 所需的酶是具有鏈置換功能的Bst DNA 聚合酶，并且RT-LAMP 還需要添加抑制酶和逆轉錄酶；緩沖液的主要作用是在LAMP 擴增過程中起輔助和緩沖在適當的條件下進行反應；引物組包括外部引物和內部引物，外部引物和內部引物的濃度不同；與此同時，鎂離子和dNTP 的參與也非常重要，在這些試劑的共同作用下，酶才能進行充分反應。并且LAMP 反應中各個試劑的濃度也會影響到反應進程，所以對體系中濃度的優化可以提高LAMP反應的效率［9］。

1.3 LAMP方法的特點

1.3.1 高效、快速、耗時短 整個擴增反應在恒定溫度（60～65℃）進行，過程中不需要經過普通PCR那樣幾十次循環的變性退火延伸過程，體系反應時間大大縮短，通常在60 min 內就可以完成反應并檢測指定樣品［10］。

1.3.2 特異性比較強 設計LAMP 引物的過程較繁瑣，LAMP 的4 條引物主要是針對靶基因的6 個區域進行設計，并且這6 個區域之間的序列識別有嚴格的順序性，這決定了LAMP方法具有較高的特異性。

1.3.3 操作便捷且對儀器設備要求不高 LAMP 反應全程在固定溫度（常在60～65℃）中完成，所以只有確保等溫環境即可，對儀器要求不高，特別是對于基層實驗室，常見的水浴鍋就能滿足要求。

1.3.4 靈敏度高 LAMP 反應的靈敏度非常高，并且能夠在短時間內對樣品進行擴增，擴增的數量級可以達到107數量級，最低能夠檢測到10 pg/μL 的樣品，比普通PCR 靈敏100 倍，并且LAMP 反應的準確性和實時熒光PCR 相當，因此當檢測病毒量較少的樣品時，LAMP方法比較適合［11］。

1.3.5 能夠直接擴增RNA LAMP 方法可直接擴增RNA，并且可以向體系中加入適量的逆轉錄酶和抑制酶，以實現一步法RT-LAMP的擴增。

1.3.6 結果判定簡便 LAMP 反應會形成大量白色沉淀物，可以通過肉眼直接觀察，還可以利用實時濁度儀進行全程監控，通過沉淀產生的時間和產生的量進行數據的量化，判斷擴增的效率及效果，提高條件優化的效率，準確掌握方法的靈敏度，反應結束也不需要通過凝膠電泳進行觀察，可以省去這一繁瑣的過程，也避免試劑的污染［12］。

1.3.7 LAMP反應的缺點 LAMP反應至少需要涉及4條特異性引物，并且對序列的特異性要求特別高，如果設計不合理，可能會導致非目標擴增鏈的產生，嚴重影響到結果的判斷，與此同時，LAMP 實驗過程容易污染，則可能難以檢測并且不能檢測到靶基因的序列。另外，引物的長度也是LAMP 反應的一個關鍵點，所以在LAMP 引物設計過程中引物的長度最好在300 bp以內［13］。

1.4 LAMP的產物檢測

1.4.1 直接法 在LAMP反應期間、擴增過程中會產生白色沉淀物焦磷酸鎂，如果該產物達到一定濃度，則可以直接通過肉眼進行觀察，因此通過肉眼觀察產物中有無沉淀的產生是最直接簡單明了的檢測方法［14］。

1.4.2 間接法

1）隨著科技的進步，研究人員研制出了可以對LAMP反應整個過程進行實時監控的儀器——LAMP 濁度儀，可以對LAMP 反應過程中產生的白色沉淀進行實時分析，并且每一秒的濁度都是通過數據進行呈現，然后可以根據該數據繪制曲線，直觀地觀察到LAMP 反應的實時濁度，還可以分析反應速率，對比不同的樣品［15］。

2）熒光染料可以與LAMP 反應過程中產生的雙鏈DNA 結合，產生熒光信號，因此，將SYBR Green I 等熒光染料添加到產物中后，產物的顏色會發生變化，如果產物為陽性，則產物的顏色會變成熒光綠色，如果沒有變色則說明該產物是陰性［16］。

3）通過瓊脂糖凝膠電泳也可以觀察到LAMP 擴增產物，電泳后，在瓊脂糖凝膠上可以看到清晰的梯形帶，便于觀察。通過凝膠電泳觀測，電泳圖如果產生了梯形條帶則證明產物是陽性，反之則是陰性［17-18］。

2 LAMP技術在植物病毒檢測中的應用

2.1 植物DNA病毒的檢測

植物DNA 病毒種類相對較少，目前應用LAMP 技術檢測植物DNA 病毒的研究也相對較少。其中較為典型的植物DNA 病毒有花椰菜花葉病毒，其具有重要經濟價值和生物學意義，其在35S 啟動子區域含有3個轉錄因子專一的結合位點［19-20］。

FUKUTA 等［21］建立的基于CaMV35S啟動子的LAMP 檢測方法，可檢測出轉基因大豆及其產品中含量為0.5%～5%的轉基因成分。孫敏等［22］采用LAMP 方法檢測花椰菜花葉病毒CaMV35S 啟動子，靈敏度可達0.002%，遠高于歐盟標準，且LAMP 檢測法與實時熒光PCR 法的檢測結果完全相同。陳金松等［23］針對玉米表達載體的花椰菜花葉病毒35S啟動子（CaMV35S）的6個區域設計4 種特異引物，建立轉基因玉米花椰菜花葉病毒35S 啟動子環介導等溫擴增技術檢測方法，為檢測轉基因玉米花椰菜花葉病毒35S啟動子提供了一種更加簡便快速的方法。肖維威等［24］針對CaMV35S 啟動子設計4 對特異性引物，建立的LAMP 法具有快速、簡單、可視化、靈敏度高和特異性強等優點，可應用于轉基因產品的初步篩選。

2.2 植物RNA病毒的檢測

對于RNA 病毒的檢測，科研工作者采取在LAMP 體系內加入RNA 酶抑制劑和RNA 逆轉錄酶，從而建立了逆轉錄LAMP（reverse transcription LAMP，RT-LAMP）技術，RT-LAMP 技術可省去反轉錄的步驟和減少在擴增核酸過程的污染幾率，該方法在速度上快于RT-PCR 檢測方法，靈敏度也是RT-PCR的10～100倍。

RT-LAMP 技 術 由NOTOMI 等［3］建立，但首先應用該技術檢測RNA 病毒的則是FUKUTA 等人，應用該技術快速檢測出了葉片、種子、根、莖中的日本紅薯花葉病毒（JYMV）［25］。NIE［26］分別利用RT-LAMP技術檢測了240 份樣品中的植物Y 病毒屬（Potato Virus Y），檢出率均為97.5%。國內劉雅馨等［27］用RT-LAMP 方法對疑似感染櫻桃小果病的樣品進行檢測，在35 個樣品中檢測出13 個樣品感染了LChv-1，檢測結果與RT-PCR 法一致。RT-LAMP 法具有特異性強、操作簡單、快速等特點，適合對LChV-1樣品的快速檢測與鑒定。

袁英哲等［28］用RT-LAMP 方法在新疆甜瓜種子中檢測出黃瓜花葉病毒（CMV）和小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV），與常規的PCR 技術相比，靈敏度比常規RT-PCR 高10～100 倍，提高了檢測的效率。LE 等［29］2 h內完成了RNA 快速提取到RT-LAMP 檢測，檢測出水稻條紋病毒（RSV），水稻東格魯桿狀病毒（RTBV），靈敏度比RT-PCR 高10倍。FUKUTA 等［30］建立了感染番茄的菊花斑點枯萎病毒RT-LAMP 檢測體系，靈敏度是RT-PCR 的100 倍，整個擴增過程不到1 h，在擴增過程中，加入了環引物，濁度20 min 就開始增加，大大提高了反應的可視度。聞偉剛等［31］在菜豆莢斑駁病毒（BPMV）RT-LAMP 體系中加入了2 條環引物，靈敏度是RT-PCR 的1 000 倍，從核酸的提取到結果觀察只需要2～2.5 h，該研究說明環引物可以大幅提高反應速度和效率。

除上述病毒外，吳凡等［32］建立了桑脈帶相關病毒的RT-LAMP 檢測體系；鄒佳伶等［33］建立了獼猴桃褪綠環斑病毒RT-LAMP 檢測體系；KUAN 等［34］建立了南瓜曲葉病毒（SLCV）LAMP 快速檢測體系；康明蛟等［35-36］建立了植物卷葉病毒RT- LAMP和豇豆重花葉病毒（CPSMV）的RT-LAMP 檢測體系；高彥萍等［37］對植物卷葉病毒（PLRV）RT-LAMP 的方法進行了優化，優化后的RT-LAMP 檢測結果與RT-PCR一致。

2.3 植物類病毒的檢測

類病毒是目前為止發現的侵染植物的最小病原物，類病毒不編碼任何蛋白，完全依靠寄主植物進行復制，在復制過程中引起病癥，并且癥狀與病毒引起的病癥極為相似，很難區分，侵染過程不顯性，造成檢測鑒定較為困難［2］。由于類病毒不產生蛋白質，傳統的血清學方法不能滿足檢測需求，而LAMP方法的出現為類病毒的檢測提供了新的思路，該方法可以滿足類病毒檢測的特殊性，實現類病毒的高特異性和靈敏檢測。比較有代表性的類病毒是植物紡錘塊莖類病毒（PSTVd），大多數植物感染該病毒都不顯癥狀，并且潛育期很長，前期無法判斷是否感染了該病毒，較難檢測。TSUTSUMI等［38］利用RT-LAMP方法在番茄的葉片、塊莖、種子內檢測出PSTVd，靈敏度是RT-PCR的10倍，所需的時間是RT-PCR的一半。另外，果樹類病毒檢測中LAMP技術也有應用，桃潛隱花葉類病毒（PLMVd）是危害桃的病原之一，不僅影響水果的品質和口感，還影響果樹的長勢，引起倒伏等癥狀，對次年桃樹的生長發育產生嚴重影響，因此，希臘學者BOUBOURAKAS等［39］建立了PLMVd的RT-LAMP檢測體系，32 min即可在桃樣品中檢測出該類病毒，與RT-PCR的180 min相比，具有高效、快速特點，此外，該體系還能夠在其他果樹樣品中檢測到該類病毒。國內辛言言等［40］建立了蘋果銹果類病（ASSVd）的RT-LAMP 檢測方法，具有靈敏度高、特異性強和檢測時間短的特點，可用于現場ASSVd的快速檢測。

3 展望

RT-LAMP 檢測技術有假陽性的缺陷，所以在體系建立過程中最好采用濁度儀實時檢測濁度，避免產物檢測的污染，同時通過設置空白對照的方式以確定沒有產生假陽性，并且通過重復性試驗結果可以判斷，RT-LAMP 不但具有重復性的特征，在重復的過程中不產生假陽性。在實際操作過程中，必須在超凈工作臺中進行RT-LAMP 體系的建立，RT-LAMP的產物必須及時丟棄，保證樣品不被污染［41］。

在LAMP 檢測過程中，可以與免疫磁珠捕獲結合進行分子檢測，該方法可以大大縮短時間，實現互補優勢，更易于操作且經濟；并且可以通過在引物對里添加環引物的方式提高RT-LAMP的反應速率［42］。

LAMP 技術雖因建立時間較短，還存在諸多問題，但其在大多數植物病毒檢測方面表現出特異性強、靈敏性高、產物檢測方便等優點，使其在植物病毒快速檢測研究中應用價值越來越明顯，目前，該技術在植物病原、醫學病原、食品檢測等方面均有應用且效果良好。相信隨著該技術的不斷完善，該方法作為分子生物的一種快速檢測技術必將為及時控制重大植物病害的發生和流行、災變預警、分子病理學研究等提供技術支撐。