LEITD與HPLC測定非典型抗精神病類藥物血藥濃度的比較研究*

張 琦，沈 薇，史東風，王奕慶，錢小年，楊思杰

1.上海市民政第三精神衛生中心檢驗科，上海 200435；2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海 200435

近年來，我國精神疾病發病率呈現上升趨勢，隨之市場上出現了多種抗精神病類藥物。利培酮、奧氮平、喹硫平屬于非典型抗精神病類藥物。相關研究表明，由于利培酮、奧氮平、喹硫平的血藥濃度治療區間相對狹窄，有效的血藥濃度與中毒濃度相近，同時由于患者存在個體差異，引起的不良反應也較大，在治療的過程中應常規化監測血藥濃度，以求能在最小不良作用情況下發揮藥物的最大療效，實現臨床用藥個體化[1-6]。因此，基于個體藥理差異對抗精神病藥物進行血藥濃度監測，從而進行定量調節是更加科學的治療方法。膠乳增強免疫透射比濁法(LEITD)、高效液相色譜法(HPLC)均是目前已有報道的檢測體內抗精神病類藥物血藥濃度的方法[7-9]。HPLC樣本預處理復雜，對檢驗人員和儀器要求高，成本高。LEITD具有操作簡單，耗時短等優點，臨床應用廣泛，但有研究報道其檢測特異度稍差[10]，目前尚無定論。因此，篩選出適合臨床治療的抗精神病類藥物血藥濃度常規監測方法具有重要臨床意義。本研究通過分析HPLC和LEITD檢測接受非典型抗精神病類藥物治療患者血液樣本中非典型抗精神病類藥物血藥濃度，利用線性回歸方式評價對比系統(即采用HPLC檢測)與試驗系統(即采用LEITD檢測)檢測數據的相關性，進而驗證二者與治療藥物監測(TDM)的等效性，旨在建立一種臨床便捷的抗精神病類藥物血藥濃度測定方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取上海市民政第三精神衛生中心精神科2021年4-9月住院的符合精神分裂癥標準進行抗精神病類藥物TDM的219例患者作為研究對象，男109例、女110例，平均年齡(46.26±13.21)歲。所有患者按服用非典型抗精神病類藥物的不同分組，其中服用利培酮為A組(100例)、奧氮平為B組(59例)、喹硫平為C組(60例)；非典型抗精神病類藥物低、中、高3個質量濃度質量控制(以下簡稱質控)樣本和去離子水作為質量監測，以保證檢測數據的可靠性。各組性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均口服用藥，且服藥頻次為1次/天或2次/天。納入標準：(1)符合《疾病和有關健康問題的國際統計分類》(ICD-10)的精神分裂癥診斷標準[11]；(2)陽性與陰性癥狀量表(PANSS)總評分≥60分；(3)年齡18～60歲，性別不限，漢族；(4)總病程為1個月以上、5年以下，首發或復發的精神分裂癥；(5)經患者和其監護人同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)血常規、尿常規、肝腎功能、心電圖等實驗室檢查結果有明顯異常；(2)伴有嚴重或不穩定的心、肝、腎和內分泌等軀體疾病、神經系統疾病和其他精神障礙，繼發于其他軀體疾病；(3)有酒精或精神活性物質濫用；(4)有強烈自殺、攻擊傾向；(5)對帕利哌酮有過敏史；(6)妊娠或哺乳期女性，有可能在試驗期間懷孕的女性；(7)無人監護，不能遵循醫囑服藥。本研究已通過上海市民政第三精神衛生中心倫理委員會的審批通過。

1.2儀器與試劑 ANAX FLC 2421全自動二維色譜儀(湖南德米特儀器有限公司)；ATX224萬分之一0.1 mg分析天平(日本島津公司)；TGL-16B高速離心機(上海安亭科學儀器有限公司)；XH-B型旋渦混合器(上海市康健醫療器具有限公司)；日立7180全自動生化分析儀(日本日立公司)；LEITD檢測藥物血藥濃度試劑盒[復星診斷科技(上海)有限公司]。均采用日立7180全自動生化分析儀檢測。利培酮、奧氮平、喹硫平3種藥物標準品、質控品(低、中、高3個水平)均由湖南德米特儀器有限公司提供。

1.3方法

1.3.1樣本收集 根據患者所用非典型抗精神病類藥物分類采集，在患者服藥達穩態后，檢測當日清晨空腹血清，采血管需用無添加劑真空管，各采血3 mL，3 500 r/mim，離心5 min，分別取上層血清1 mL作為樣本，放置4 ℃保存待測。

1.3.2HPLC 采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，注入的樣本由流動相帶入色譜柱內，各組分在柱內經分子間作用力在流動相與固定相間進行吸附-解吸過程，使得各組分被分離，并進入檢測器檢測，由積分儀器或者數據處理系統記錄和處理色譜信號。質控方案:每日常規檢測時與待檢樣本平行檢測,運用 3個質控濃度水平觀察質控通過。做好標準曲線圖，且本研究數據均在各藥物血藥濃度的可檢測范圍內。

色譜條件如下，一維柱：Aston SX1(3.5 mm×25 mm,5 μm)；中間柱：Aston SCB(3.5 mm×10 mm,5 μm)；二維柱：Aston SCB(4.6 mm×125 mm,5 μm)。

奧氮平檢測步驟如下：處理方式，ORG-1 1 000 μL+血樣400 μL高速離心后取上清液；檢測波長、CH1(288 nm)，CH2(298 nm)；流速，A泵(1.20 mL/min)、B泵(0.01 mL/min)、C泵(0.80 mL/min)；溫度40 ℃；進樣體積500 μL。

利培酮檢測步驟如下：處理方式，ORG-1 1 000 μL+血樣400 μL高速離心后取上清；檢測波長，CH1(276 nm)、CH2(286 nm)；流速，A泵(1.20 mL/min)、B泵(0.01 mL/min)、C泵(0.80 mL/min)；溫度40 ℃；進樣體積500 μL。

喹硫平檢測步驟如下：處理方式，ORG-1 1 000 μL+血樣400 μL高速離心后取上清；檢測波長，CH1(286 nm)、CH2(286 nm)；流速，A泵(1.20 mL/min)、B泵(0.01 mL/min)、C泵(0.80 mL/min)；溫度40 ℃；進樣體積300 μL。

不同非典型抗精神病類藥物在不同紫外光譜中有特性吸收(奧氮平為260 nm、利培酮與帕利哌酮為276 nm、喹硫平為286 nm)，利用二維高效液相色譜儀的二維分離原理對不同非典型抗精神病類藥物進行色譜分析，利用紫外檢測器處理不同非典型抗精神病類藥物特征信號，通過外標法計算有效濃度。

1.3.3LEITD 將抗體交聯到納米膠乳顆粒的表面，試劑中的多價藥物共軛體會與樣本中的被測藥物競爭結合納米顆粒表面的抗體。當樣本中沒有游離的被測藥物分子時，反應產生大量的聚集物，溶液吸光度增加。將待測樣本前處理好后，放入已經通過質量控制的日立7180全自動生化分析儀中進行檢測。當樣本中含有被測藥物時，凝聚反應被部分抑制，鍵合到樣本中藥物分子的抗體不能形成納米顆粒聚集物，導致溶液吸光度下降。通過在600 nm處測定溶液吸光度的變化，即可測得各藥物的濃度。

2 結 果

2.1HPLC測定藥物血藥濃度數據及標準曲線和質控水平的建立 經檢驗，利培酮、奧氮平、喹硫平標準曲線圖及質量控制結果確保試驗準確，利培酮、奧氮平、喹硫平標準曲線均符合方法學驗證要求，具有良好的線性關系。以喹硫平質控色譜圖確認為基準，3種藥物質控檢測結果均符合質量控制要求。喹硫平、利培酮、奧氮平轉移回收率分別為95.51%、96.27%、100.20%，符合轉移回收率要求(90%～110%)；標準曲線R2=0.999符合方法學驗證要求；質控結果偏差滿足方法驗證要求，色譜圖純凈無干擾；部分QCL出現基線漂移為流動性未平衡所致，檢測結果均在線性范圍內，并未影響結果。

2.2HPLC和LEITD測定非典型抗精神病類藥物血藥濃度結果比較 LEITD與HPLC檢測利培酮、喹硫平、奧氮平這3種非典型抗精神病類藥物血藥濃度結果差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 HPLC和LEITD測定非典型抗精神病類藥物血藥濃度結果比較

2.3兩種方法測定結果一致性評價 LEITD與HPLC的檢測結果進行Kappa一致性分析，結果顯示，兩種方法對奧氮平測定結果的Kappa值為0.96，對喹硫平測定結果的Kappa值為0.90，均具有良好的一致性，但兩種方法對利培酮測定結果的Kappa值為0.62，一致性欠佳。

2.4兩種方法測定結果相關性評價 HPLC和LEITD對利培酮、喹硫平、奧氮平這3種非典型抗精神病類藥物血藥濃度的測定結果，具有良好的相關性，且均呈正相關(r=0.944、0.993、0.991，P<0.05)。HPLC測定結果(X)與LEITD測定結果(Y)作回歸分析，方程分別為利培酮：Y=0.853 9X+6.254 9；奧氮平：Y=0.994 4X-0.727 8；喹硫平：Y=0.956 1X+3.440 5。見圖1～3。

圖1 HPLC和LEITD測定利培酮濃度的相關性

圖2 HPLC和LEITD測定奧氮平濃度的相關性

圖3 HPLC和LEITD測定喹硫平濃度的相關性

3 討 論

近年來隨著TDM研究的逐漸深入，臨床對患者的血藥濃度監測已應用于多種精神病學及神經內科的藥物范疇[10-11]。研究表明，TDM可以有效指導臨床用藥，實現個體化給藥，達到最佳治療效果，因此建立一種臨床便捷的方法進行藥物血藥濃度的測定是當今臨床面臨的一個重要問題[12]。本研究對HPLC和LEITD兩種方法測定結果進行對比，考察兩種方法的準確度及相關性，確定結果的一致性，并將藥物濃度控制在安全有效范圍內，使藥物在發揮最大療效的同時，產生的不良作用最小，從而提高治療療效[13]。

LEITD的缺點是靈敏度和特異度較HPLC更低，但HPLC由于檢測設備與耗材價格昂貴，樣本前處理煩鎖，檢測過程耗時長，且需要專職的技術人員進行操作，并不適合于臨床規模化、批量化檢測需求[14]。因此，本研究希望找到能替代HPLC的更好的檢測方法。本研究中，HPLC的標準曲線與質量控制均為在控水平，排除其檢測結果的不確定性，以HPLC作為參考方法，確保了本研究的準確性及公正性。

本研究結果表明，采用LEITD和HPLC對患者血液中非典型抗精神病類藥物血藥濃度進行檢測，兩種測定方法檢測結果均呈正相關(r=0.944、0.993、0.991，P<0.05)。同時，LEITD與HPLC檢測利培酮、喹硫平、奧氮平這3種非典型抗精神病類藥物血藥濃度結果差異均無統計學意義(P>0.05)。LEITD和HPLC測定奧氮平和喹硫平的結果具有良好的一致性。但兩種方法對利培酮的測定結果一致性欠佳，分析原因可能是利培酮在使用HPLC測定時，其測定結果為利培酮與9-羥利培酮的總和計算所得，因此會與LEITD測定結果產生一定誤差。提示在檢測喹硫平、奧氮平這兩種非典型抗精神病類藥物時，LEITD與HPLC具有良好的相關性和一致性，可優先考慮運用LEITD作為非典型抗精神病類藥物血藥濃度的檢測方法。

相關研究表明，HPLC對抗精神病類藥物濃度的最低檢出限為5 ng/mL，但樣本實際使用量較大，而LEITD實際使用樣本量僅為HPLC的1/30，另外LEITD可避免色譜類檢測方法所涉及的危險類化學品使用不當而導致的意外情況發生，并且也可節省因購買色譜類專用儀器及其維護保養的高昂成本等[15]。

因此，從多方面考慮LEITD在非典型抗精神病類藥物血藥濃度監測中具有一定的臨床應用意義，其為臨床提供了一種更快速、簡便的檢測工具，且適合于開展臨床藥代動力學及需要較低濃度樣本測定非典型的研究[16-17]。本研究比較兩種方法測定抗精神病類藥物的血藥濃度情況，結果表明，兩種方法的方法學參數均符合非典型抗精神病類藥物的測定要求，臨床實際樣本測定結果一致性較好，HPLC作為藥物濃度檢測的經典方法，其在靈敏度和準確性方面有其獨特的優勢，而LEITD與HPLC比較，無需另外購置專用儀器，自動化程度高，檢測速度快，更適合臨床規模化、批量化的檢測需求，可減少人為因素對檢測的影響，并快速有效地提供檢測結果，降低檢測周期，有利于臨床對患者服藥后實際情況的及時掌握，有效幫助臨床醫生為每例患者制訂個體化的用藥劑量，實現精準醫療。