小柴胡湯聯合抗菌藥物對CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型的影響分析*

高 吟,張立紅△,張志斌,周春剛,周永華

1.無錫市中醫醫院檢驗科，江蘇無錫 214000；2.江蘇省血吸蟲防治研究所，江蘇無錫 214000

膿毒癥屬于臨床危重疾病，多伴隨腹膜炎，該病在創傷、感染等應激狀態下，損傷腸道的屏障功能，進一步導致腸源性感染及炎癥性介質毒性網絡的產生，造成腸道內大量的細菌和內毒素經門靜脈及淋巴系統侵入血液循環，從而引起全身多器官功能衰竭[1-2]。腹膜炎/膿毒癥的具體發病機制較復雜，其具有病死率高、并發癥多等特征，內皮細胞、中性粒細胞、單核-巨噬細胞所釋放的大量細胞因子、炎性介質均為該病發病過程的關鍵性物質[3]。耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型是當前較常見的動物模型，具有建模效率高、操作方便等特征。當前有關西醫治療膿毒癥的思路為對癥治療，包括水電解質平衡的維持、調節免疫、抗感染、清除炎癥因子等，頭孢哌酮/舒巴坦等均為膿毒癥常用抗菌藥物。西藥治療雖能降低病死率，但可導致機體出現耐藥性，也伴隨發生一定的不良反應[4]。隨著中醫藥的不斷發展和進步，中藥治療膿毒癥取得了很好的效果，小柴胡湯由柴胡、生姜、大棗、黃芩、人參、半夏、甘草等組成，具有抗炎和增強人體免疫功能的作用，也可發揮解表清里的功效，使邪毒隨糟粕排出體外[5-6]。本研究探討與分析了小柴胡湯聯合抗菌藥物對CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型的影響，并簡單闡述了其相關機制。

1 材料與方法

1.1材料來源 由無錫市中醫醫院SPF動物實驗中心提供的清潔級3月齡雌性SD大鼠[體質量為(200.00±20.00)g]購自北京維通利華公司(動物質量合格證號SCXK2021-0006-152)。大鼠分籠飼養(每籠6只)，均進行標準大鼠飼料喂養，定期清除籠內異物，可自由飲食、飲水和活動，飼養條件是室溫18～28 ℃，相對濕度62%～80%。

1.2儀器與試劑 小柴胡湯由蘭州太寶制藥有限公司提供(國藥準字Z62021311)，酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，CRAB由無錫市中醫醫院提供。亞胺培南購自浙江海正藥業股份有限公司(國藥準字H20070067)，頭孢哌酮/舒巴坦購自湖南方盛制藥股份有限公司(國藥準字H20067077)，抗Notch-1抗體、抗端粒酶調節相關蛋白(TRAP)抗體、抗β-actin抗體購自美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型的建立 CRAB在MHA平板上生長、傳代，腹腔注射0.5 mL/20 g CRAB與5%豬粘蛋白到大鼠中，建立CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型。造模成功條件如下：(1)動物體溫下降、休克等，且模型的自然死亡率>50%，死亡時間與模型制備時間間隔>12 h；(2)細菌血培養陽性；(3)各臟器病理出現炎性損傷、壞死等改變。

1.3.2模型分組與治療 將36只CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠隨機分為3組：模型組、西藥組與聯合用藥組，每組12只。西藥組給予皮下注射頭孢哌酮/舒巴坦[240/120 mg/(kg·12 h)]+亞胺培南[156 mg/(kg·12 h)]，2次/天。聯合用藥組在西藥組治療的基礎上給予小柴胡湯中藥提取液[組方：柴胡30 g，黃芩、人參、半夏、甘草(炙)、生姜(切)各9 g、大棗(擘)4枚]0.3 mg/kg灌胃，2次/天。模型組每日灌胃生理鹽水。3組均治療觀察7 d。

1.3.3觀察指標 3組分別在治療第3天與第7天處死6只大鼠，然后進行以下檢測。(1)采用Kuebler方法檢測肺組織的髓過氧化物酶(MPO)水平，可以有效評價肺組織中性粒細胞的滲出程度。大鼠右肺標本用濾紙吸去表面液體后稱重，烤箱內加熱72 h再稱重，計算肺標本的干濕指數。(2)對大鼠心臟進行取血，離心(1 500 r/min離心10 min)后收集上清液，-80 ℃冰箱保存，采用酶聯免疫吸附試驗檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)水平。(3)無菌條件下分離大鼠的部分臟器，4%甲醛固定進行HE染色。(4)分離大鼠的肺組織并研磨，進行總蛋白的提取，采用二喹啉甲酸(BCA)方法定量蛋白質水平。

2 結 果

2.1一般情況對比 模型組：大鼠軀體蜷縮，眼目不睜，活動減少，對刺激反應遲鈍，精神萎靡嗜睡，被毛蓬松少光澤。西藥組與聯合用藥組：大鼠的活動性、進食飲水狀況、反應性均優于模型組。

2.2肺MPO水平與干濕指數對比 西藥組與聯合用藥組治療第3天與第7天的肺MPO水平及干濕指數均低于模型組(P<0.05)，聯合用藥組低于西藥組(P<0.05)。見表1。

表1 3組治療不同時間點的肺MPO水平及干濕指數對比

2.3血清炎癥因子水平對比 西藥組與聯合用藥組治療第3天與第7天的血清TNF-α和IL-6水平均低于模型組(P<0.05)，聯合用藥組低于西藥組(P<0.05)。見表2。

表2 3組治療不同時間點的血清炎癥因子水平對比

2.4Notch1、TRAP蛋白相對表達水平對比 西藥組與聯合用藥組治療第3天與第7天的肺Notch1、TRAP蛋白相對表達水平均低于模型組(P<0.05)，聯合用藥組低于西藥組(P<0.05)。見表3。

表3 3組治療不同時間點的肺Notch1、TRAP蛋白相對表達水平對比

3 討 論

腹膜炎/膿毒癥具有極高的發病率和病死率，其中肺臟由于肺循環濾過全身血液，肺組織內存在大量單核巨噬細胞，使之成為膿毒癥發生時最易受損傷的器官。腸道在發生膿毒癥時也易受到損傷，膿毒癥可導致腸道細菌移位與腸道細胞凋亡，從而加重病情。同時腹膜炎/膿毒癥可通過刺激淋巴組織導致免疫激活，繼續損傷腸道黏膜，形成惡性循環，最終導致全身多臟器功能不全[7]。中醫認為，膿毒癥患者多毒邪外犯、壯熱汗出、邪毒亢盛、邪正斗爭劇烈，津液運化失司、瘀血阻滯脈絡、大腸傳導功能失常[8]。本研究結果顯示，西藥組與聯合用藥組治療第3天與第7天的肺MPO水平及干濕指數低于模型組，聯合用藥組低于西藥組，表明小柴胡湯聯合抗菌藥物在CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型中的應用能降低肺MPO水平與干濕指數。從機制上看，小柴胡湯為表里雙解劑，功效為內瀉熱結、和解少陽。現代藥理研究提示，柴胡的主要化學成分為糖類、黃酮類、皂苷類、香豆素類、揮發油類等，其具有良好的調節免疫功能與抗炎作用，可有效恢復膿毒癥患者的免疫平衡[9]。黃芩含有黃酮類化合物、多糖、揮發油等各種成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用。小柴胡湯的應用具有保護腸黏膜屏障、抑制胰腺分泌磷脂酶A2等作用，對膿毒癥的治療也具有較好的前景。孢哌酮/舒巴坦+亞胺培南等抗菌藥物，可抑制體內的病原體的細胞壁及細胞核的合成，進而抑制其繁殖，起到不可逆的抑制作用，且抗菌藥物可迅速進入腹水達到殺菌濃度，進而發揮抗炎抗菌的作用。二者合用，可加強抗炎作用，并提高人體免疫功能[10-11]。

腹膜炎/膿毒癥的發生機制目前仍未完全闡明，適量的炎癥因子有利于機體正常防御反應，但炎癥因子的大量釋放則可產生廣泛的損傷作用。TNF-α是機體受到有害刺激后最初分泌的細胞因子，可誘導IL-6表達，促使炎癥細胞因子之間相互作用并形成正反饋環，誘發“級聯效應”。IL-6的高表達可激活核轉錄因子κB，從而導致膿毒癥進一步加重。有研究表明，TNF-α可由激活的中性粒細胞和巨噬細胞釋放，而對各種免疫細胞和結構細胞產生刺激，進而誘導機體釋放大量炎癥介質，最終引起全身炎性反應[12]。本研究結果顯示，西藥組與聯合用藥組治療第3天與第7天的血清TNF-α和IL-6水平低于模型組，聯合用藥組低于西藥組，表明小柴胡湯在CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型中的應用可抑制炎癥因子的表達。從機制上分析，小柴胡湯和抗菌藥物二者聯用除了可以抗炎和增強人體免疫功能，也能發揮腸道保護和減少細菌移位等作用，從而減輕全身炎性反應[13]。

Notch信號通路被發現可參與多種疾病的發生、發展，Notch-1是Notch受體的重要類型。當Notch信號通路被激活時，會增加Notch-1的表達，進而引發下游靶基因的激活。TRAP也是調節膿毒癥發生、發展的關鍵因子，可調節破骨細胞的生成和活化，通過正反饋加重炎性反應，并促進炎癥介質的大量釋放。本研究結果顯示，西藥組與聯合用藥組治療第3天與第7天的肺Notch1、TRAP蛋白相對表達水平低于模型組，聯合用藥組低于西藥組，表明小柴胡湯聯合抗菌藥物在CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型中的應用可抑制Notch1、TRAP蛋白的表達。小柴胡湯可作用于線粒體中有氧呼吸的過程，進而影響機體能量代謝，從而緩解因膿毒癥引起的微循環障礙。此外，小柴胡湯可從“神經-內分泌-免疫-代謝”等多層面影響膿毒癥的發生與發展，從而對肺臟起到保護作用[14-15]。本研究也存在一定的不足，如未設置空白對照組，也未進行不同劑量的組別分析，筆者將在后續研究中探討。

綜上所述，小柴胡湯聯合抗菌藥物在CRAB致腹膜炎/膿毒癥大鼠模型中的應用能抑制Notch1、TRAP蛋白的表達，抑制炎癥因子的表達，從而降低肺MPO水平及干濕指數。