Galectin-3、VEGF-C、SFRP1在宮頸鱗癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸炎組織中的表達(dá)及其臨床意義

劉 艷,馮 寧

西安市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710003

Galectin-3作為一種β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，其相對分子質(zhì)量約31×103，是半乳糖凝集素家族中唯一具有嵌合結(jié)構(gòu)的成員，其不僅包含環(huán)繞于碳水化合物結(jié)合位點(diǎn)的Galectin家族共有的球形結(jié)構(gòu)，能特異性識別并結(jié)合β-半乳糖殘基，也合并12個氨基酸殘疾的氨基末端結(jié)構(gòu)域，可與糖復(fù)合物細(xì)胞表面結(jié)合從而發(fā)揮對應(yīng)功能，同時還富含甘氨酸、脯氨酸等類α-膠原序列，是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)底物[1]。而血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)又稱VEGF相關(guān)蛋白，作為VEGF家族新成員，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一淋巴血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子；分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(SFRP1)則作為核心元件參與Wnt信號傳導(dǎo)通路，在腫瘤的形成、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[2]。近年來，有研究指出Galectin-3、VEGF-C、SFRP1皆與宮頸鱗癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)及宮頸炎等宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)[3]。鑒于此，現(xiàn)采集臨床標(biāo)本著重對Galectin-3、VEGF-C、SFRP1在宮頸鱗癌、CIN及宮頸炎組織中的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行分析，旨在為宮頸病變的早期診斷及治療提供理論及實(shí)驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2016年7月至2020年8月在本院手術(shù)切除并經(jīng)手術(shù)病理組織學(xué)證實(shí)為宮頸鱗癌的標(biāo)本57份，術(shù)前均未經(jīng)放療或化療，年齡40～65歲，平均(50.27±6.12)歲；采集因CIN而行宮頸椎切或子宮全切的宮頸組織標(biāo)本57份，年齡31～55歲，平均(40.27±3.85)歲；另選取48份慢性宮頸炎活檢標(biāo)本，年齡21～50歲，平均(31.66±4.27)歲。所納入病例標(biāo)本均有明確病理組織學(xué)診斷證據(jù)[4]，標(biāo)本納入前患者均未接受任何治療，標(biāo)本采集均經(jīng)患者知情同意，并簽署研究相關(guān)同意書。

1.2方法 Galectin-3、VEGF-C、SFRP1的表達(dá)情況均采用免疫組織化學(xué)法檢測，鼠抗人Galectin-3單克隆抗體、兔抗人多克隆抗體VEGF-C、免疫組織化學(xué)ElivisonTMPlus試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒(DAB-0031)、磷酸鹽緩沖液均來自福建邁新生物科技，兔抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物科技，具體操作如下：(1)將浸泡(浸泡溶液為重鉻酸鉀)24 h的載玻片沖洗后60 ℃烤箱烤干后，再次置入1∶10多聚-L-賴氨酸溶液中浸泡5 s瀝干，并60 ℃烤箱烤干備用；(2)標(biāo)本采集后常規(guī)應(yīng)用福爾馬林固定，石蠟包埋，將其連續(xù)切成厚度4 μm的組織切片，并置入70 ℃熱水展開，將展開處理后的潔凈載玻片置于室溫干燥，時間為10 min，再置于60 ℃烤箱烘烤30 min；(3)采用增強(qiáng)聚合物法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色處理，先常規(guī)二甲苯脫蠟及酒精梯度脫水處理后使用磷酸鹽緩沖液沖洗，重復(fù)3次，3分鐘/次，再將3%H2O2滴于切片組織，每個切片1滴，室溫孵育10 min后磷酸鹽緩沖液沖洗，重復(fù)3次，3分鐘/次，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性后進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)后除去磷酸鹽緩沖液，并將每張切片加入1滴相應(yīng)第一抗體，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，3分鐘/次，再次除去磷酸鹽緩沖液，分別將每張切片滴加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，3分鐘/次，再次除去磷酸鹽緩沖液，切片滴加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，5分鐘/次，再次除去磷酸鹽緩沖液，切片滴加1滴二甲聯(lián)苯胺液，顯微鏡下觀察3～10 min，若顯色為陽性則終止顯色，最后蒸餾水沖洗、蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)二甲苯透明，梯度濃度乙醇脫水后采用中性樹膠封固，晾干后在400倍鏡下觀察結(jié)果。

1.3Galectin-3、VEGF-C、SFRP1陽性表達(dá)評價標(biāo)準(zhǔn) 均在顯微鏡(×400)下選取5個代表性區(qū)域進(jìn)行觀察并計數(shù)，Galectin-3陽性評價標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒均提示陽性表達(dá)，其中棕黃色顆粒占總細(xì)胞總數(shù)的百分比>75%皆為強(qiáng)陽性(+++)、棕黃色顆粒占總細(xì)胞總數(shù)的50%～75%為中度陽性(++)、棕黃色顆粒占總細(xì)胞總數(shù)的25%～<50%為陽性(+)、棕黃色顆粒占總細(xì)胞總數(shù)的百分比<25%則為陰性(-)；VEGF-C、SFRP1蛋白陽性評價標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見淡黃色至棕黃色顆粒均提示VEGF-C陽性表達(dá)，而細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒則提示SFRP1陽性表達(dá)，將著色情況按強(qiáng)度依次分為無(0分)、弱陽性(1分)、中等陽性(2分)、強(qiáng)陽性(3分)，陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比分級為無陽性細(xì)胞(0分)、陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比<25%(1分)、陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的25%～<50%(2分)、陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的50%～75%(3分)、陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比>75%(4分)，以陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合評估陽性表達(dá)等級，0分為陰性(-)、1～2分為陽性(+)、3～4分為中陽性(++)、5～7分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4觀察指標(biāo) (1)Galectin-3、VEGF-C、SFRP1蛋白在宮頸鱗癌、CIN及宮頸炎組織中的表達(dá)情況；(2)不同國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期、組織學(xué)分化程度及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌及不同分級的CIN組織中Galectin-3、VEGF-C、SFRP1陽性表達(dá)率。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Galectin-3、VEGF-C、SFRP1在宮頸鱗癌、CIN及宮頸炎組織中的表達(dá)情況 Galectin-3、VEGF-C、SFRP1在宮頸鱗癌、CIN及宮頸炎組織中的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；宮頸鱗癌、CIN、宮頸炎組織中Galectin-3、VEGF-C陽性表達(dá)率依次降低(P<0.05)；宮頸鱗癌、CIN中SFRP1陽性表達(dá)率均低于宮頸炎組織(P<0.05)；宮頸鱗癌、CIN中Galectin-3、SFRP1陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 Galectin-3、VEGF-C、SFRP1蛋白在宮頸鱗癌、CIN及宮頸炎組織中的表達(dá)情況[n(%)]

2.2Galectin-3、VEGF-C、SFRP1與宮頸鱗癌、CIN的臨床病理特征的關(guān)系 Galectin-3陽性表達(dá)率隨FIGO分級增加而上升(P<0.05)，低分化組織陽性表達(dá)率高于中分化及高分化組織(P<0.05)，且隨CIN分期增加而上升(P<0.05)，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中Galectin-3陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。VEGF-C陽性表達(dá)率隨FIGO分期增加而上升(P<0.05)，且低分化組織陽性表達(dá)率高于中分化及高分化組織(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中VEGF-C陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織(P<0.05)，雖然不同分級的CIN組織中VEGF-C陽性表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但CINⅢ級陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ級、Ⅱ級(P<0.05)；SFRP1在宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率隨FIGO分期增加而下降(P<0.05)，且低分化組織陽性表達(dá)率低于中分化及高分化組織(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)，CINⅢ級組織中SFRP1陽性表達(dá)率低于Ⅰ級、Ⅱ級(P<0.05)。見表2。

表2 Galectin-3、VEGF-C、SFRP1蛋白與宮頸鱗癌、CIN的臨床病理特征的關(guān)系分析[n(%)]

續(xù)表2 Galectin-3、VEGF-C、SFRP1蛋白與宮頸鱗癌、CIN的臨床病理特征的關(guān)系分析[n(%)]

3 討 論

Galectin-3存在于胃黏膜、乳腺上皮、單核細(xì)胞等多種人體正常組織及胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中，可通過與細(xì)胞內(nèi)糖蛋白、細(xì)胞表面分子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的作用參與至細(xì)胞的增殖、黏附、凋亡，并誘導(dǎo)血管新生、信使RNA前提剪接等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]。本研究中，宮頸鱗癌組織中Galectin-3陽性表達(dá)率明顯高于CIN、宮頸炎組織，且Galectin-3陽性表達(dá)率隨FIGO分期的進(jìn)展而上升，低分化宮頸鱗癌中Galectin-3陽性表達(dá)率也明顯高于中分化、高分化宮頸鱗癌組織，且隨CIN分級增加而上升(P<0.05)，但淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中Galectin-3陽性表達(dá)率與無淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。陳立江等[6]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測Galectin-3陽性表達(dá)后也指出，Galectin-3在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于CIN組織及正常宮頸組織，且其陽性表達(dá)率與病理分級呈正相關(guān)，但該研究中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中Galectin-3陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，這與本研究結(jié)果略有差異。DIETLMEIER等[7]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中Galectin-3陽性表達(dá)率亦高于正常宮頸組織，且在不同分級的CIN組織中表達(dá)無明顯差異，Galectin-3陽性表達(dá)與FIGO分期、組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)，且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸鱗癌組織中Galectin-3陽性表達(dá)高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，分析不同研究結(jié)果的差異可能與標(biāo)本取樣差異有關(guān)，但由此可見，Galectin-3陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究仍需進(jìn)一步探討。

本研究中，VEGF-C在宮頸鱗癌、CIN、宮頸炎組織中的陽性表達(dá)率逐漸增加，且VEGF-C陽性表達(dá)率隨FIGO分期的增加而上升，低分化宮頸鱗癌組織中Galectin-3陽性表達(dá)率明顯高于中分化及高分化組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中Galectin-3陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸鱗癌組織(P<0.05)。研究證明，VEGF-C在促進(jìn)腫瘤血管形成中扮演著重要角色，并直接參與宮頸鱗癌血管的形成，VEGF-C的高陽性表達(dá)為腫瘤生長提供了有利條件[8]；而吉潔等[9]證實(shí)，宮頸癌組織中VEGF-C陽性表達(dá)率明顯高于CIN組織，但VEGF-C在宮頸慢性炎癥組織中未見陽性表達(dá)，且VEGF-C陽性表達(dá)率隨宮頸癌臨床分期、病理組織學(xué)分期的進(jìn)展而升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中VEGF-C陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，CINⅢ級組織中VEGF-C陽性表達(dá)率高于CINⅠ、Ⅱ級，這與本研究結(jié)果相符，均提示VEGF-C高表達(dá)與宮頸鱗癌組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等密切相關(guān)，分析VEGF-C可通過對宮頸鱗癌組織周圍及內(nèi)部淋巴管的生成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，受人乳頭瘤病毒持續(xù)感染的宮頸上皮高表達(dá)VEGF-C，最終誘導(dǎo)淋巴管新生，與其他致癌危險因素共同加速CIN進(jìn)展至宮頸癌，并發(fā)生轉(zhuǎn)移[10-12]。

有研究表明，Wnt信號通道參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，而SFRP1屬于分泌型糖蛋白家族，與卷曲蛋白(FZ)具有較高的同源性，可直接作用于Wnt信號通道并組織Wnt與FZ結(jié)合，抑制Wnt信號通道激活，通過對SFRP1啟動子的甲基化后可抑制SFRP1的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，故認(rèn)為SFRP1在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用[13-15]。而本研究中，宮頸鱗癌及CIN組織中SFRP1陽性表達(dá)率明顯低于宮頸炎組織，但SFRP1陽性表達(dá)率在宮頸鱗癌及CIN組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。YANG等[16]針對肺腺癌患者的研究也指出，SFRP1在肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，其與肺腺癌組織分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且組織分化程度越低，SFRP1表達(dá)率越低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織SFRP1陽性表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，這與本研究結(jié)果一致。有研究結(jié)果表明，胃癌組織中SFRP1陽性表達(dá)率較低，且臨床分期越高，分化程度越低，SFRP1陽性表達(dá)率越低，這與本研究結(jié)果一致，但該研究指出，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中SFRP1蛋白陽性表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，這與本研究結(jié)果有差異[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-196a-1高表達(dá)水平與胃癌低生存率明顯相關(guān)。高侵襲性胃癌細(xì)胞分泌含有miR-196a-1的外泌體，異位表達(dá)的miR-196a-1通過靶向SFRP1促進(jìn)低侵襲性胃癌細(xì)胞的侵襲[18-20]。

Galectin-3、VEGF-C、SFRP1或與宮頸鱗癌、CIN及宮頸炎等宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，但至今尚未完全明了，仍有極大深入探究的空間，需大量科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床試驗予以進(jìn)一步補(bǔ)充、論證及完善，為宮頸鱗癌、CIN的診斷、評估及治療提供新思路。

綜上所述，Galectin-3、VEGF-C、SFRP1在宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，Galectin-3、VEGF-C、SFRP1與宮頸鱗癌、CIN及宮頸炎等宮頸病變的關(guān)系仍需更嚴(yán)謹(jǐn)、更大樣本量的研究予以深入探究。