核型分析聯合CNV-seq技術在羊水染色體嵌合體檢測中的應用

高明雅,柴玉瓊,王亞男

洛陽市婦幼保健院醫學遺傳與產前診斷科，河南洛陽 471000

羊水染色體嵌合體是產前診斷中發現的一類常見核型異常，但嵌合體形成機制復雜，存在真假性嵌合，因此給臨床咨詢工作帶來很大難度和挑戰。傳統觀點認為，在染色體異常的診斷中，常規染色體核型分析是確診的重要手段，也是臨床首選的方法[1]。但羊水染色體核型分析受取樣、體外培養、制片等多種因素影響，也存在一定的漏診和誤診。因此，有研究認為，羊水染色體核型分析結果提示嵌合的孕婦應使用其他檢測技術進一步驗證[2]。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展及檢測成本的降低，越來越多的產前診斷中心把染色體核型分析聯合基因組拷貝數變異測序(CNV-seq)技術作為產前診斷的有效策略[3]，二者聯合檢測，可極大提高染色體嵌合體檢測的靈敏度。本研究擬就本院行羊水穿刺后進行兩種方法聯合檢測的羊水標本進行回顧性分析，探討兩種方法羊水染色體嵌合體診斷中的準確性，并進一步分析不同產前診斷指征孕婦在羊水染色體核型的嵌合情況，期望能為臨床正確處理和解釋羊水染色體嵌合體提供一定的理論依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年8月至2020年12月在本院醫學遺傳與產前診斷科進行羊水穿刺的孕婦3 920例為研究對象，按照產前診斷指征分為4類，(1)高齡：預產期年齡≥35歲；(2)血清學篩查高風險：本實驗室采用四聯篩查方案進行篩查，即游離絨毛膜促性腺激素(free-β-HCG)+甲胎蛋白(AFP)+游離雌三醇(uE3)+抑制素A(InhA)，按照豐華血清學篩查試劑盒說明書界定21-三體綜合征高危值為1/270，18-三體綜合征高危值為1/350；(3)無創產前檢測(NIPT)結果異常；(4)超聲結果異常：包括胎兒頸部透明帶厚度(NT)增厚、結構異常等因素。納入者孕周控制在18～24周，無羊水穿刺禁忌證，孕婦均簽署羊水穿刺核型分析與CNV-seq技術檢測知情同意書。

1.2方法

1.2.1超聲引導下經腹羊膜腔穿刺術 超聲引導下采用21G穿刺針對孕婦行穿刺手術，為避免母細胞污染，先抽取羊水2 mL丟棄，改換注射器后繼續抽取羊水3管，每管約10 mL，兩管用于細胞培養，剩余1管提取DNA行 CNV-seq技術檢測。

1.2.2羊水染色體核型分析 兩管羊水分別按兩線獨立操作，Ⅰ線采用德國cytogen培養基，Ⅱ線采用廣州白云山培養基，分別置于兩臺培養箱獨立培養。9～10 d后使用消化法收獲細胞并制片。G顯帶染色后萊卡自動掃描儀掃片分析，計數不少于來自于兩線培養的20個細胞，分析不少于5個完整細胞。按照《胎兒染色體核型分析判讀指南》[4]對羊水染色體嵌合體情況進行評估，必要時加大計數和分析數量。

1.2.3CNV-seq技術檢測方法 取剩余羊水標本5 mL離心，根據TIANGEN DNA提取試劑盒說明書操作，提取終濃度≥5 ng/L DNA作為模板構建測序文庫，550AR測序儀進行低深度測序，分析并記錄23對染色體非整倍體改變及100 kb以上的缺失及重復。CNV改變按照國際系統標準進行命名。

1.3統計學處理 采用Excel對數據進行整理。

2 結 果

2.1胎兒染色體嵌合體檢出情況 在3 920例羊水標本中，核型分析檢出嵌合體共19例，檢出率為0.48%，CNV-seq技術檢出嵌合體共12例，檢出率為0.33%，二者聯合檢測檢出嵌合體共21例，檢出率為0.53%。其中有兩例核型分析結果正常而CNV-seq技術檢測結果提示異常的標本，后經FISH檢測驗證后為真性嵌合體；1例核型分析結果提示為2號染色體三體低比例嵌合(嵌合比例9%)的病例，CNV-seq技術檢測檢出嵌合體比例高達33%；兩例特納與超雌的嵌合體，因嵌合比例基本為1∶1，而造成性染色體的DNA總量變化不大，因此CNV-seq技術檢測結果顯示均為正常。見表1。

表1 核型分析與CNV-seq技術檢測羊水嵌合體結果統計

續表1 核型分析與CNV-seq技術檢測羊水嵌合體結果統計

2.2不同產前診斷指征孕婦羊水染色體嵌合體檢出情況比較 按照產前診斷指征不同將接受羊水穿刺的孕婦分為4組，最終，在檢出的21例羊水染色體嵌合體病例中，血清學篩查高風險有10例，占比最高，其次為NIPT結果異常，共檢出6例嵌合體，高齡3例，超聲結果異常2例，見表2。

表2 不同產前診斷指征孕婦嵌合體檢出情況(n)

2.3羊水染色體嵌合體類型 在羊水標本檢出的21例染色體嵌合體中，性染色體數目或結構異常嵌合體最多，共12例，其次為常染色體數目異常，共7例。1例核型分析結果中出現標記染色體嵌合體，但不能明確來源，進一步CNV-seq技術檢測明確該標記染色體為1號染色體部分短臂嵌合重復。見表3。

表3 羊水染色體嵌合體類型(n)

3 討 論

羊水染色體嵌合體，是指受精卵在早期卵裂過程中，由于染色體核內復制、染色體不分離、丟失、斷裂重接等多種因素造成染色體數目或結構異常，而出現兩種或兩種以上核型的個體[5]。羊水染色體嵌合體是產前診斷工作中常見的異常結果，其形成機制復雜。除了真性嵌合體外，特定情況下，如體外培養過程中的異常增殖，也會導致羊水假性嵌合體現象[6]。因此，準確鑒別胎兒是否存在染色體嵌合體及嵌合體的性質，對決定孕婦的妊娠結局尤為重要。

染色體核型分析早在20世紀60年代就已被作為臨床診斷染色體異常的“金標準”。但是，羊水染色體核型分析技術受到取材、體外培養、制片等多種因素的影響，在診斷低比例嵌合體及判斷真假性嵌合體方面存在明顯不足。有研究認為，當羊水核型分析發現嵌合體，需進一步加做細胞分裂間期的FISH檢測，若嵌合體比例超過20%，也可采用拷貝數變異檢測技術進行確認[7]。CNV-seq技術是近年發展起來的分子細胞學技術，可對未培養的分裂間期細胞進行檢測，且分辨率高，檢測周期短，檢測范圍廣，很好地彌補了單一羊水核型分析檢測的不足，能夠更加準確地輔助診斷羊水染色體嵌合體，提高檢測的靈敏度和準確度[8-9]。

本研究對本院3 920例經羊水穿刺取材的標本行染色體核型分析和CNV-seq技術檢測，結果顯示核型分析檢出的嵌合體共19例，檢出率為0.48%，CNV-seq技術檢測檢出嵌合體共12例，檢出率為0.33%，二者聯合檢出嵌合體共21例，檢出率為0.53%，與文獻報道的羊水染色體嵌合體檢出率基本一致[10-11]。值得注意的是，兩例羊水核型分析結果未見明顯異常的病例，CNV-seq技術檢測檢出嵌合體，后經FISH檢測證實為真性嵌合體。1例核型分析結果提示為2號染色體三體低比例嵌合(嵌合比例9%)的病例，CNV-seq技術檢測檢出嵌合體比例高達33%，后期超聲結果發現多項畸形而引產。由此可見，羊水染色體核型分析因為經過長時間的體外培養，其結果僅代表成功貼壁并形成克隆的細胞結果。在這一過程中，一些未能貼壁的死細胞被淘汰，且培養過程中正常細胞可能因為優勢生長而使異常細胞的嵌合體比例降低，最終導致核型分析出現漏檢或結果偏差的情況。而CNV-seq技術檢測是直接對未培養的細胞進行檢測，包括羊水中的活細胞和死細胞，較好地避開了核型分析的劣勢[12-13]。此外，由于常規G顯帶核型分析只能檢出5 Mb以上的缺失重復，因此，該方法無法檢出小片段微缺失微重復的嵌合體，對于核型分析結果中出現的一些標記染色體也不能明確性質，而CNV-seq技術檢測的分辨率可以達到100 kb，在對微缺失微重復的嵌合體檢測中發揮重要作用，對于核型分析結果不能明確的標記染色體也能明確其性質。在本研究中，1例核型分析結果提示出現小的標記染色體嵌合體，CNV-seq技術檢測明確其為1號染色體部分短臂嵌合重復，因該片段包含明確致病基因，孕婦及家屬慎重考慮后決定及時終止妊娠。對于類似病例，兩種檢測方法聯合應用，互為補充，很大程度地縮短了孕婦的產診周期，避免后期追加分子檢測造成長時間等待，不僅可以減輕孕婦心理壓力，當出現不可避免終止妊娠時也可以避免因孕周過大引產困難而造成孕婦身體損傷。

CNV-seq技術檢測雖然在羊水染色體嵌合體的診斷中可以很好地彌補核型分析的不足，但是，由于該技術是基于二代測序技術對DNA總量的檢測，因此，對于一些遺傳物質總量不變，僅有結構異常的變異還不能有效檢出。如本研究中，有幾例平衡易位嵌合，CNV-seq技術檢測均未能分辨出。除此之外，在性染色體的檢測中，CNV-seq技術檢測也存在不足，如本研究中的兩例特納與超雌的嵌合體，因嵌合比例基本為1∶1，而造成性染色體的DNA總量變化不大，因此CNV-seq技術檢測結果顯示均為正常。另外，對于不平衡的性染色體嵌合體，CNV-seq技術檢測也僅能檢測出性染色體含量變化，但對具體的核型表現形式無法準確判斷，尚需結合核型分析精準解讀。

在本研究的3 920例羊水標本中，診斷出嵌合體的產前診斷指征包括唐氏篩查高風險、NIPT結果異常、超聲結果異常、高齡等。本研究中血清學篩查采用的是四聯篩查方案，早有研究證實了free-β-HCG、AFP、uE3、InhA結合孕婦年齡、孕周及體質量等參數對產前篩查染色體異常及神經管缺陷的有效性[14-15]。在本研究中，血清學篩查高風險組檢出的嵌合體最多，這也從側面證實了王莉芬等[16]、葉盛等[17]提出的觀點，即血清學篩查結果的意義不應該僅僅局限于提示21-三體綜合征、18-三體綜合征兩類常見的染色體異常，其他染色體異常可能也會導致血清中激素水平異常，從而導致篩查結果提示高風險。另外，對于高齡孕婦來說，由于生殖細胞老化、體內各種毒素的堆積，都將導致胎兒染色體出現異常的風險升高[18]。在本研究中，也有多例高齡孕婦出現染色體嵌合體的情況。這說明年齡風險可能體現在細胞分裂周期的各個階段，高齡妊娠不僅增加了21-三體綜合征的風險，其他染色體異常風險也隨之增加。

綜上所述，隨著生化免疫學、超聲診斷學的發展，常規的產前篩查手段在一定程度上提高了胎兒染色體異常的檢出率。因此，對于常規產前篩查高風險的孕婦，應納入高危妊娠管理，進一步轉診至有產前診斷資質的診斷中心進行產前診斷與檢測。在產前診斷方法的選擇上，推薦常規核型分析聯合CNV-seq技術檢測，這不僅可以彌補單一檢測方法帶來的漏診和誤診，也在很大程度上縮短了產診周期，減輕孕產婦的心理壓力，同時可為臨床產前遺傳咨詢提供更加全面的實驗室依據。