基于高通量測序的拷貝數變異檢測技術在產前診斷中的臨床應用*

呂康琪，陳大洋，闞麗娟，熊 丹 綜述,張秀明△ 審校

1.新鄉醫學院，河南新鄉 453000；2.深圳市羅湖醫院集團醫學檢驗實驗室/深圳大學第三附屬醫院檢驗科，廣東深圳 518001

我國是出生缺陷高發國家之一，出生缺陷發生率高達5.6%，每年新增出生缺陷患兒約900 000例，出生時臨床可見缺陷患兒數高達250 000例，這一嚴重現象給家庭和社會都帶來了巨大壓力[1]。其中80%以上的出生缺陷由染色體畸變引起，在染色體結構變異中最主要的變異類型是拷貝數變異(CNV)[2]。CNV是指染色體上DNA片段大小范圍從1 kb到幾個Mb的亞顯微水平的基因組變異，包括缺失和重復兩種類型[3]。由CNV導致的疾病目前沒有有效的治療方法，及時進行產前診斷是防治出生缺陷的重要手段。傳統的產前診斷方法，如染色體核型分析、超聲檢查等因通量低、分辨率低、檢測周期長等原因無法滿足臨床需求[4]。近幾年，基于下一代測序(NGS)技術的CNV-seq為CNV的檢測提供了新手段，美國婦產科醫師學會(ACOG)已推薦CNV-seq作為胎兒結構異常時診斷評估的一線檢測方法[5]。

1 檢測方法

CNV-seq采用NGS技術對標本DNA進行低深度全基因組測序，再通過生物信息分析受檢標本中是否存在CNV[6]。目前，序列深度法檢測CNV是臨床上廣泛使用的檢測手段，該方法根據CNV重復或缺失變異產生的測序深度信號來進行統計分析，若拷貝數發生重復變異，會顯示較高的讀取深度，若發生缺失，則出現較低的讀取深度[7]，見圖1。序列深度法的檢測流程主要有5步，(1)數據比對：將質量合格的下機序列映射到人類參考基因組上進行比對；(2)窗口劃分：為基因組測序統計檢驗設定統計單位[8]；(3)GC含量矯正：在DNA雙鏈結構中，GC堿基對含3個氫鍵，高GC區域結構更加穩定，DNA不容易被打斷，此穩定結構會影響測序片段深度變化而造成結果假陽性，為了使窗口深度更均一，需要對GC含量進行矯正[8]；(4)斷點分割：通過統計學方法分析序列深度，發現異常序列深度的窗口，對變異斷點進行合并，找出變異區域；(5)可視化：通過展示條帶分布與染色體核型標準圖對全基因組的序列分布進行可視化。

圖1 序列深度法檢測CNV時缺失和重復的深度信號

由于CNV-seq技術局限、基因組自身特征、遺傳復雜性等因素可能會造成CNV測序結果的假陽性，因此需要對檢測出的CNV片段進行過濾[9]。過濾的具體原因包括以下幾點，(1)染色體N區：技術局限導致染色體N區遺傳信息無法檢測，造成序列深度較低，可能引起假陽性；(2)染色體著絲粒附近：染色體著絲粒由高度重復DNA序列組成，影響序列深度異常變化，可能引起假陽性[10]；(3)低于檢測閾值數據：CNV-seq主要針對100 kb以上CNV造成的疾病，而對于<100 kb的CNV需要過濾。基于低深度測序技術原理，CNV-seq檢測不能排除多倍體、單親二倍體、染色體平衡易位、倒位、環狀、低比例嵌合體等原因造成的疾病，但其具有通量高，成本低，DNA需求量低，操作簡便，可檢測低至5%的染色體非整倍體嵌合等優點，提高了變異檢出率和臨床適用性[2]。

2 致病性CNV解讀考慮因素

需要注意的是檢出的CNV并不都意味著異常或有臨床意義。目前臨床基因組資源中心(ClinGen)數據庫收錄的具有明確致病性的CNV共有2 817個，僅占據全基因組CNV的一小部分。應用CNV-seq技術可以檢測到大量變異，但真正具有致病性的十分罕見，大部分變異因解讀信息有限，只能被定義為臨床意義未明，因此需要更多的研究確定其臨床意義。為了明確實驗室對CNV結果的評價分類并促進解讀結果的一致性，國際上2019年美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)和ClinGin聯合發表了CNV解讀和報告指南[11]，國內專家在2020年發表了《產前遺傳學診斷拷貝數變異和純合區域的數據分析解讀及報告規范化共識》[12]。ACMG指南實現了CNV致病性的量化分類，將CNV分為5類：致病性、可能致病、臨床意義未明、可能良性、良性。《產前遺傳學診斷拷貝數變異和純合區域的數據分析解讀及報告規范化共識》對CNV的數據分析流程、報告標準和報告內容進行了規范[12]。盡管國內外都出臺了相關指南和專家共識，但具體細節仍存在差異，特別是在解讀報告的透明性、一致性上，各個臨床實驗室間差別較大。因此，對CNV的解讀需考慮以下幾個因素。

2.1CNV包含的基因 分析CNV涉及區域內的基因是解讀CNV最常考慮的因素。首先應對CNV涉及的基因組構成進行討論。考慮CNV中是否包含獨特的、富含基因的序列或重復元件，分析CNV的重復或缺失片段是否包含蛋白質編碼基因或其他已知功能的重要元件，若包含則CNV會對蛋白編碼產生影響，造成臨床表型異常，引起致病性[13]；若僅涉及部分基因的拷貝數增加或缺失，則會造成基因斷裂或編碼序列改變，而涉及內含子序列的變異會對基因功能產生影響，使致病風險增加[14]。然而，若檢測到的CNV未包含明確致病性基因而無法判斷其臨床意義時，應查詢數據庫或檢索PubMed對基因進行評估。其次，應對CNV涉及的基因數量進行討論，若包含的基因數量過多，則致病風險增加，如當拷貝數缺失區域包含35個及以上蛋白編碼基因時，該CNV定義為可能致病；若包含基因數量少，則致病風險降低；需要明確的是，如果該變異區域包含的基因數量很少，但含有明確致病性基因，此CNV則被定義為致病性[15]。

2.2數據庫 可用于解讀CNV的數據庫主要分為3大類：第1類為疾病人群變異數據庫，主要收集臨床表型、明確致病性基因等，包括ClinGen、DECIPHER、在線人類孟德爾遺傳(OMIM)、HGMD數據庫等；第2類為健康人群變異數據庫，主要收集變異在自然人群中的分布頻率、族群信息等，包括基因組變異體數據庫(DGV)、gnomAD數據庫等；第3類主要收集基因組學注釋信息，包括基因內含子、外顯子、5′端或3′端重要元件等，主要是UCSC、GeneBank數據庫。

2.3文獻查詢 可以通過檢索是否有相似CNV或變異區域所涉及基因的文獻報道，幫助臨床分析，為CNV解讀提供新思路。常用的檢索平臺是PubMed、Web of Science、中國知網、萬方數據知識服務平臺等。

2.4家族遺傳 在許多情況下，若檢測到臨床意義未明的CNV時，對父母進行基因組測序是十分必要的。當變異來自表型健康父母時，該變異致病性可能較低，若變異為新發，則致病性可能較高。在特殊情況時，可能還需要其他的家族標本(如兄弟姐妹)來確定特定的CNV是否與家族中的染色體變異相關。遺傳異質性和遺傳外顯率也是影響基因型和表型關系的重要因素。低外顯率是指外顯率為5%～10%，這種基因組變異的臨床表現很難被精準預測，且外顯率會受到多種因素的影響，如種族、家族史、額外的CNV等[16]。

3 CNV-seq在產前診斷領域的應用現狀

3.1CNV-seq與染色體核型分析的聯合應用 20世紀70年代以來，傳統的染色體核型分析是評估高危孕婦胎兒染色體異常的“金標準”。此技術可以檢測胎兒染色體數目異常、染色體非整倍體、倒位、平衡或非平衡易位等結構異常[17]。染色體核型分析技術的分辨率為5～10 Mb，<5 Mb的異常很難被準確檢出，而CNV-seq不能檢出平衡易位、羅氏易位等結構異常，因此染色體核型分析與CNV-seq聯合檢測可以克服兩種技術中存在的缺陷，為產前提供更可靠更全面的遺傳診斷[18]。魏友華等[19]采用以上兩種方法對905例羊水標本進行檢測，均發現70例染色體數目異常、9例染色體嵌合體異常、7例染色體非平衡性結構異常，染色體核型分析額外檢測到由羅氏異位引起的染色體數目異常，CNV-seq額外檢測到10例明確致病性的染色體微缺失/微重復，兩者聯合應用將染色體異常陽性率從11.27%提升至12.38%。彭亞琴等[20]對164例孕婦進行檢測，核型分析檢出24例染色體核型異常，CNV-seq檢出29例已知致病性和可疑致病性CNV，使致病性CNV檢出率提高了3.05%，但CNV-seq未能檢出3例染色體核型分析診斷為平衡易位、羅氏異位的異常。上述研究表明，核型分析和CNV-seq聯合應用可以顯著提高染色體異常檢出率，有利于臨床產前咨詢評估，可為孕婦是否繼續妊娠提供更加全面客觀的依據。

3.2CNV-seq與染色體微陣列分析技術(CMA)的對比應用 CMA是一種已成熟運用于臨床的高分辨率全基因組CNV分析技術，ACMG推薦CMA作為胎兒染色體異常時診斷評估的輔助手段[21]，但該技術存在培養周期長、成本高、通量低、探針更新停滯等問題[22]。MA等[23]對67例嵌合體孕婦進行CNV-seq和CMA檢測，CNV-seq的檢出率為6%～92%，CMA的檢出率為20%～72%。WANG等[24]對1 023例孕婦進行檢測，CMA檢出121例染色體異常(11.8%)，CNV-seq不僅檢測到了上述所有異常，并且額外檢出了17例染色體異常。以上研究證明，CNV-seq較CMA對嵌合體有更高的分辨率和靈敏度。據上述研究分析原因發現，CMA未檢出異常的原因是平臺靶區探針覆蓋不足或探針覆蓋不到。

3.3CNV-seq在不同臨床指征中的應用

3.3.1CNV-seq在超聲結果異常中的應用 超聲診斷是臨床應用最廣泛、最常見、公認無損傷性、可反復進行的醫學成像技術，也是胎兒生長發育情況的重要判定指標之一[25]。對超聲結果異常的病例進行CNV-seq檢測，不僅可以幫助產前確定變異類型，而且有利于分析遺傳原因。張秀群等[26]對137例超聲檢查提示胎兒結構異常的孕婦進行CNV-seq檢測，發現有15例異常，其中8例為已知致病性CNV，超聲結果分別是6例提示頸項透明層(NT)增厚或側腦室增寬，1例提示胎兒尺骨缺如、左腎缺如、心室內多發強光斑，1例提示胎兒生長發育受限。CNV-seq不僅可以在超聲結構異常病例中分析遺傳變異，還可以在超聲發現軟指標的病例中探索病因，幫助臨床深入分析病例特征，提升診斷價值。胎兒超聲軟指標多見于NT增厚，針對NT增厚，已有研究對臨床病例進行了CNV-seq檢測，發現在NT增厚的139例病例中檢出45例CNV，除了33例是>5 Mb的染色體異常，余下的12例均是染色體微缺失/微重復[27]。

3.3.2CNV-seq在高齡孕婦中的應用 隨著三孩政策放開，高齡(≥35歲)孕產婦的數量明顯增加，研究表明胎兒染色體異常的發生率與孕婦年齡密切相關，因此為高齡孕婦提供產前診斷是減少出生缺陷兒的有效手段[28]。王游聲等[29]對孕婦年齡和染色體異常的相關性進行了研究，發現在35歲以上的7個年齡組中，從38歲起隨著孕婦年齡增長，染色體異常率逐漸升高。一項研究發現，31例引產孕婦中單純因高齡而發現胎兒異常導致引產的病例有10例，占32.26%，因此相對而言，高齡孕婦更容易生育異常胎兒[30]。以上研究證明，高齡與染色體異常密切相關，可以通過CNV-seq技術檢測染色體異常，從而降低出生缺陷的發生率，有助于我國出生缺陷的防治。

3.3.3CNV-seq在無創產前檢測(NIPT)高風險中的應用 NIPT指通過檢測母體血漿中游離DNA片段而判斷胎兒是否存在染色體非整倍體異常或其他遺傳性疾病，主要用于篩查21、18、13三體綜合征[31]。有研究對563例NIPT篩查為三體綜合征的孕婦進行CNV-seq檢測，發現489例孕婦羊水檢出CNV，分析74例出現假陽性結果的原因是由于母體CNV的干擾，因此若NIPT提示高風險時，仍需要進行CNV-seq檢測確認，排除母體干擾[32]。另有研究對45 773例孕婦進行NIPT篩查，314例檢出性染色體非整倍體，經羊膜穿刺術驗證，58例病例檢出CNV，結果仍有很高的假陽性率[33]。以上研究說明，對于NIPT高風險的孕婦，可以進行CNV-seq檢測驗證。NIPT只是一種篩查測試，因此可能出現假陽性或假陰性的情況。2016年我國國家衛生健康委員會發布了《孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查與診斷技術規范》，明確指出對于NIPT高風險人群，應轉診至產前遺傳咨詢醫師處進行檢測和咨詢[34]。

4 小 結

在過去的幾年，我國有效防治出生缺陷的方法是進行產前診斷，而CNV-seq為產前診斷提供了新途徑。在CNV-seq的檢測原理方面，序列深度法已獲得臨床認同；在臨床應用方面，該技術不僅實現了與其他傳統技術的聯合運用，而且也被應用到不同指征病例中，實現了優勢互補，提升了我國產前診斷領域的檢測能力，提高了檢測效率；在解讀方面，從包含的基因、數據庫、文獻查詢和家族遺傳這4個方面進行總結，然而由于明確致病性的基因或區域數量有限，很多檢測結果無法給出具有臨床意義的解釋，且CNV結果解讀流程復雜、專業性強，盡管國內外已出臺了相關指南和專家共識，但具體細節仍存在差異，特別是在解讀報告的透明性、一致性和標準化方面，各個臨床實驗室之間差別較大。因此，CNV-seq結果解讀仍存在很多問題，需要進一步探索CNV致病性評估，推動CNV-seq在產前診斷領域的發展。