單純餐后高血糖癥的非靶向代謝組學研究

娜孜熱木·夏甫開提 孫 威 楊 蕾 沈 靜 肖 輝

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是全世界高發的疾病之一[1]。國際糖尿病聯合會 (International Diabetes Federation，IDF) 數據顯示，2019年全球糖尿病患者約為4.63億，預計2045年全球總患病人數將達到7億[2]。單純餐后高血糖癥 (isolated post-challenge hyperglycaemia,IPH)主要表現為空腹血糖(fasting plasmaglucose,FPG)<7.0mmol/L而2h餐后血糖(2h-PG)≥11.1mmol/L[3]。研究表明,我國糖尿病患者經口服糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)診斷的新發糖尿病患者中，有46.6%的患者僅表現為單純餐后血糖水平升高而空腹血糖水平處于正常，漏診率達60.7%[4]。本研究利用非靶向代謝組學方法，試圖找到IPH患者空腹血清中的特征標志物，從而降低漏診率，達到早發現、早干預治療的重要現實意義。

對象與方法

1.研究對象：選擇2020年9月11日～2021年1月31日期間于烏魯木齊友誼醫院體檢的374例受檢者，根據研究目的分為餐后高血糖病例組(IPH組)、2型糖尿病組(T2DM組)和正常對照組。經性別、年齡基線資料匹配后，確定每組研究對象為20例。

2.納入與排除標準：納入標準：①年齡35～65歲；②長期(≥5年)居住于烏魯木齊市；③符合相關組入組分類標準，T2DM組診斷標準：空腹血糖濃度≥7.0mmol/L(空腹的定義為至少8h未攝入能量)，OGTT試驗2h血糖≥11.1mmo1/L(依照WHO推薦的執行方法，將75g無水葡萄糖溶于水中作為糖負荷)；IPH組診斷標準：空腹血糖濃度<7.0mmol/L 和2h餐后血糖濃度≥11.1mmo1/L；正常糖耐量即空腹血糖和2h餐后血糖均為正常。排除標準:①有嚴重肝臟、腎臟疾病；②患高血壓、遺傳病、冠心病等疾病；2型糖尿病及高血糖病情不穩定患者；③服用對試驗研究目的有潛在影響的藥物者。

3.臨床采集與保存：血樣采集12h空腹血液，采用一次性真空負壓采血管抽取肘靜脈血10ml均放于真空管中。取5ml血樣靜置30min后，4℃ 3000r/min離心10min，取離心后的血清于-80℃凍存。

4.儀器與試劑：LC20超高效液相色譜儀購自日本Shimadzu公司；TripleTOF-6600質譜儀購自美國AB Sciex公司；渦旋混合器MIX-200購自上海凈信實業發展有限公司；離心機5427R購自德國Eppendorf公司；乙腈、甲醇、甲酸、2-氯苯丙氨酸購自美國Thermo Fisher公司。

5.樣品前處理與色譜與質譜條件及進樣方式：取樣本100μmol加入到對應的已編號的1.5ml離心管中，加入300μl純甲醇(含1ppm的2-氯苯丙氨酸)。渦旋2min，放入-20℃冰箱孵育0.5h。渦旋2min，12000r/min、4℃條件下離心10min；取200μl上清液轉移至新的1.5ml離心管中,-20℃靜置0.5h。再將上清液在12000r/min、4℃條件下離心15min。取上清液于進樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。色譜柱：Waters T3 C18柱，內徑2.1mm×100mm, 1.8μm(C18 MWM-13)；流動相A: 0.04%乙酸/水；流動相B: 0.04%乙酸/乙腈；儀器柱溫：40℃；流速：0.35ml/min；進樣量：2μl。

結 果

1.研究對象的臨床特征：3組研究對象在性別、年齡、總膽固醇、低密度脂蛋白水平方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。然而在體重指數、甘油三酯、高密度脂蛋白和糖化血紅蛋白水平方面比較，差異有統計學意義(P<0.05)。3組臨床基線資料的比較詳見表1。

表1 3組研究對象臨床基線資料比較

2.代謝組學結果：通過對3組樣本進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，結果顯示各代謝組間有分離趨勢，提示樣本代謝組存在差異。為了得到更好的組間差異效果投影圖，進行監督性多元統計分析方法，即偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)。與PCA比較，OPLS-DA可以使組間區分最大化，有利于尋找3組差異代謝物。從OPLS-DA分析結果發現，Q2=0.634,R2X=0.224，R2Y=0.995，是一個有效模型3組比較得到了明顯的分離趨勢(圖1)。基于OPLS-DA結果，獲得模型的變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)，通過選取VIP≥1可以初步篩選出不同組間差異的代謝物。同時可以結合單變量分析的P<0.05和差異倍數值(fold change,FC)FC≥2 和FC≤0.5 的代謝物來篩選出可能潛在的標志物，本研究通過S-plot，發現3組樣本都有明顯的差異代謝物(圖2)。

圖1 OPLS-DA散點得分圖

圖2 3組差異代謝物繪制S-plot圖

3.差異代謝物的篩選結果：正負離子模式下，血清樣本篩選出的差異化合物與PubChem、HMDB數據庫進行比較,3組樣本通過非靶向代謝組學方法共鑒定出1205個差異代謝物質, 包括脂類與類脂分子(28%)、有機酸(9%)、有機氮化合物(11%)、苯類化合物(11%)及其他代謝物；其中IPH組與T2DM組和正常對照組比較，分別得到24個和254個顯著差異代謝物，表2展示各組前10個顯著差異代謝物。

表2 差異代謝物篩選結果(前10項)

4.差異代謝物代謝途徑富集分析:正負離子模式下，根據差異代謝物結果進行KEGG通路富集分析，通過差異表達的代謝物中在對應通路中的個數與該通路檢測注釋到的代謝物總數的比值富集因子(rich factor)來表達富集程度，該值越大表示富集程度越大；同時觀察富集顯著性(P)值，其越接近于0，表示富集越顯著。3組的差異代謝物在94條KEGG通路中富集，其中在7條通路顯著富集(P≤0.05)，這些通路為2-氧代羧酸的代謝、氰胺酸代謝、谷胱甘肽的代謝、氨基酸的生物合成、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸的降解、托烷、哌啶和吡啶類生物堿的生物合成和牛磺酸和次牛磺酸的代謝途徑；IPH組與T2DM組差異代謝物在初級膽汁酸的生物合成和膽汁酸的分泌代謝通路中顯著富集(P≤0.05，圖3A)；與正常對照組差異代謝物則在9條代謝通路富集(圖3B)。

圖3 差異代謝物KEGG富集圖A.IPH組與T2DM組差異代謝物；B.IPH組與正常對照組差異代謝物

討 論

單純餐后高血糖癥屬糖尿病早期的亞系，與心血管疾病風險增加相關[5,6]。目前研究者認為，糖代謝在糖調節受損和糖尿病階段是存在較大的異質性，IPH可能是單純糖耐量受損病情進一步加深的結果，處于這兩種階段的患者的病理機制和發病機制有所區別[7]。本研究利用目前較認可的代謝組學方法，試找到IPH患者區別性特征標志物。

此次研究中IPH患者占22.45%(84/374)，根據《中國成人血脂異常防治指南》標準，血脂異常的IPH患者檢出率為27.38%(23/84),且血糖異常以高甘油三酯(TG)為主[8]。TG作為脂肪組織中的含量豐富的一種脂質，可影響糖、脂代謝[9]；當患者出現較高的TG水平時,就提示患者存在高血糖癥可能性[10]。按照中國成年人體重指數參考值，此次調查中超重肥胖的IPH患者51.19%(43/84)，超重和肥胖是血脂異常的主要危險因素，也與諸多代謝紊亂性疾病發病密切相關[11]。TG水平與BMI受生活習慣、飲食、年齡等的影響。新疆地區居民的膳食結構總體上呈現高蛋白、高脂肪、低維生素(蔬菜、水果攝入單一)、低礦物質的膳食模式傾向，并存在季節性飲食結構差異[12]。本研究收集樣本血清由9月(秋季)過渡到次年1月(冬季)，秋冬季寒冷且漫長，日照相對少，飲食中多熱性、味重、油膩的食品，肉、乳的消費較高。此類季節飲食特點使體內的脂肪含量增加的同時TG水平也隨之上升，從而可能增加餐后高血糖癥的發生與發展。

本研究檢測出的3組差異代謝物中占比最多為脂類和類脂分子(28%)。劉麗燕等[13]利用UPLC-Q-TOF-MS對IPH人群的血清進行代謝指紋圖譜分析，發現的17種化合物中有13種為脂類化合物。Arneth等[14]在關注代謝組學脂質譜和糖尿病早期之間的關系研究上，發現在T2DM前期患者體內存在高濃度的低碳脂質，例如甘油磷脂和鞘磷脂。同樣，本研究IPH組分別與T2DM組、正常對照組兩兩比較發現的脂類差異代謝物包括甘油磷脂、丙醇脂類、鞘脂類、脂肪酰基類和類固醇與類固醇衍生物，其中，兩個比較組共有的高表達差異代謝物甘油磷脂包括的1，2-二乙酰甘油-3-磷酸(PA、PE)和低表達單甲基磷酸乙醇胺(PE-NMe)中，前者是三乙基甘油和磷脂生物合成中的中間體，后者是細胞脂質雙層的關鍵成分。進一步來說，作為細胞膜主要組成成分的磷脂，與機體胰島素敏感度相關；既往研究表明，紅細胞膜磷脂高低變化與胰島素抵抗有關[15]。本研究初步推測上述甘油磷脂類差異代謝物作為診斷IPH的生物學標志物具有一定的特異性。

3組研究對象差異代謝物中有7%為有機酸類化合物。在既往的研究中，該膽汁酸的水平紊亂與新發疾病呈正相關，并證實與T2DM前期發病有關[16]。筆者也發現，相對于T2DM組，存在于初級膽汁中膽烷酸類-去甲膽堿酸、次級膽汁酸-去氧膽酸是IPH高表達差異代謝物。Fall等[17]研究顯示，上述兩種膽汁酸都以膽固醇為原料在肝臟中合成，并且在脂類消化吸收過程調控糖脂及能量代謝中起關鍵信號分子作用。本研究結果提示，IPH患者體內該膽汁酸代謝物發生改變并且該代謝物在通路初級膽汁酸的生物合成和膽汁酸的分泌代謝中發生紊亂。

支鏈氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸是人體重要的必需氨基酸,參與機體多重代謝過程。既往研究發現，支鏈氨基酸與胰島素抵抗密切相關，BCAAs分解代謝增加導致中間代謝物增加，潛在地導致受體應激和胰島素分泌作用受損[18,19]。本研究發現，3組差異代謝物在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解代謝途徑顯著富集，另外還在2-氧化羧酸的代謝、谷胱甘肽代謝、牛磺酸和次牛磺酸的代謝、托烷、哌啶和吡啶類生物堿的生物合成代謝通路等多條代謝途徑富集；這更加表明，與正常人群比較，IPH患者與T2DM患者機體多種代謝途徑改變。除此之外，發現的谷氨酰胺、苯丙氨酸、L-苯丙氨酰，是IPH組與兩組比較共有的差異代謝物。

在胰島素抵抗動脈粥樣硬化研究(IRAS)的參與者中，發現谷氨酰胺與谷氨酸的比率可以預測5年后的胰島素抵抗。Wang等[20]利用代謝組學技術發現，甘氨酸水平是糖耐量受損重要的預測因子。在代謝組學與2型糖尿病Meta分析研究中，233項代謝組學研究中的甘氨酸代謝表明與糖耐量受損程度呈負相關,甘氨酸和谷氨酰胺分別與11%和15%的糖尿病發生風險降低相關[21]。還有關于谷氨酰胺的8項分析中，有3項報告了顯著的反向關聯[22,23]。同樣，本研究中的該谷氨酰胺差異代謝物分別在IPH組與正常對照組的比較和T2DM組與正常對照組比較中出現，未在IPH組單獨與T2DM組比較中出現。雖該谷氨酰胺能否作為判別IPH患者的標志物尚不明確。但可以表明，與正常人群比較,IPH患者與T2DM患者該差異代謝物發生改變。

綜上所述，本實驗通過研究對象空腹血清進行代謝組學探索性研究，發現區別IPH和正常對照組與區別T2DM和IPH的生物學標志物是相同的幾種甘油磷脂類、去氧膽酸和膽酸以及氨基酸類，初步說明診斷IPH患者時該代謝物可以作為參考指標，并且該指標只利用了空腹血清檢測，可以解決IPH患者漏診現象。但關于本研究類似相關報道較少，結果重復性差。此外，本研究樣本量小、采集的樣本血清具有區域性,受生活方式、飲食習慣等因素影響，不能夠完全做出關于IPH患者的代謝紊亂的結論性陳述,需要更多的試驗研究結果來驗證。在往后的深入研究中,筆者將會進一步增加樣本量和統計指標,以期得到更好的實驗內容和實驗結論。