豬瘟病毒的基因組學及診斷技術

文│史艷華（遼寧省法庫縣農業技術推廣與行政執法中心）

豬瘟是由ASFV感染引起的一種可致豬類動物極高死亡率的疾病，其本質是動物瘟疫，也是國家聯合衛生組織在通過了衛生法研究后，通報的一類疫病。豬瘟病毒在分子結構上是一種呈現雙螺旋結構的DNA序列病毒，可以通過蜱蟲進行血液傳播與感染。在20世紀20年代，此類病毒首次在非洲被發現，并在50年代傳播到各國。直到1990年，各個國家正式認識到了此病毒對于人類社會發展與動物生存的威脅，提出了針對此類病毒的防控手段與措施。

隨著防疫手段的不斷創新與升級，豬瘟病毒已基本在各個國家內消除，直到2007年，豬瘟病毒再次在各個國家內呈現，并出現了高速繁殖的趨勢。在我國遼寧沈陽地區，2018年遭受了豬瘟病毒的侵害，動物大量死亡，不僅對該地區當時經濟建設造成了較大的影響，同時也感染到了人體。豬瘟病毒在臨床上的主要表現為高燒、發熱、嘔吐、腹瀉、厭食等現象。經過了一段時間的研究，仍未能及時產出有效治療或切斷病毒的疫苗。因此，要解決豬瘟病毒對人類造成的威脅，需要做好豬瘟病毒的診斷工作，及時發現存在異變的豬瘟病毒基因序列，將病毒對人體造成的損傷降至最低。為了落實此項工作，筆者將開展豬瘟病毒基因組學的分析，根據其基因序列，提出一種全新的診斷技術，做到對病毒的高效防治。

一、豬瘟病毒的基因組學及診斷技術

1.豬瘟病毒的基因組序列分析。豬瘟是危害我國養豬業發展的主要疫病之一，為了實現對此類病毒傳輸的切斷，需要在開展診斷技術設計與研究前，進行豬瘟病毒基因組學的分析。在此過程中，引進CSFV軟件，進行毒株基因組序列的分析，提取Brescia毒株與Alfort毒株，使用相同的方式，在軟件中進行毒株基因組的分析，分析后發現基因組測試結果分別為12589bp與12604bp，對應毒株的氨基酸序列同源性高達95%。由此可以證明，多種類型的豬瘟病毒基因組序列是相近的。

在深入對豬瘟病毒基因組序列的分析中發現，大部分基因組呈現單股、正鏈結構，具有較強的感染性，基因組在動物體內的沉降系數在35S～55S之間，分子量約為4×106單位，序列長度大約為12.1Kb，由5個非編碼區域、1個ORF區域、3個序列區域構成。基因組序列示意圖如下圖1所示。按照圖1所示的結構，即可實現對其他類型豬瘟病毒基因組序列圖的繪制。綜上所述，完成對豬瘟病毒的基因組序列分析。

2.提取豬瘟病毒基因組蛋白結構。完成對豬瘟病毒的基因組序列分析后，提取豬瘟病毒基因組蛋白結構，進行CSFV病毒的初步診斷。在此過程中應明確CSFV病毒中的ORF基因可實現對多個氨基酸蛋白的有效編碼，在完成編碼后，進行蛋白結構的解譯，并同步進行蛋白宿主細胞中毒酶的加工，通過此種方式，便可以實現對結構蛋白的生成。提取結構蛋白中以非結構方式呈現的蛋白，將其作為CSFV病毒基因組蛋白結構。

3.豬瘟病毒基因組RNA的熒光檢測與診斷。完成對基因組蛋白結構的提取后，采用熒光測試的方式，對豬瘟病毒基因組RNA進行檢測與診斷。熒光測試屬于一種自然光發光測試反應，測試中，將所選的毒株放置在培養器皿中，熒光素酶與毒株中的ATP發生化學反應，輔助使用光照儀器進行熒光效果分析，即可實現豬瘟病毒的有效診斷。

測試中，使用熒光顯微鏡鎖定毒株中的基因序列，提取蛋白結構，對其進行RNA檢測。為了提高檢測結果的精度，可在測試中輔助搭配CCD軟件測定。在此基礎上，使用共聚焦設備，對逐步測定結果進行光學層切處理，得到針對豬瘟病毒基因組RNA的三維定位信息。設定多個熒光檢測通路，選擇Timelaps進行定時取圖，此種設備在實際應用中具有較強的分辨率，可以提高檢測結果的精度與真實度。使用全內反射儀器，對毒株細胞進行膜內測試，將測試結果進行終端成像。使用雙光子設備，進行長波激發熒光顯色，此設備在實際應用中可以實現對活體組織細胞中病毒分子結構與基因組結構的測定，測定結果可以突破100微米的極限。

完成熒光檢測的相關工作后，等待培養皿中測試樣本的顯色程度，在完成完全顯色后，培養皿局部出現熒光顯色，可以提取局部組織按照上述步驟進行二次熒光測試。對于測試區域內80以上的顯色行為，即可直接得出診斷結果。通過此種方式不斷迭代處理，完成豬瘟病毒基因組RNA的熒光檢測，實現對豬瘟病毒的基因組學診斷技術的設計研究。

二、診斷技術應用效果

為了證明本文設計的豬瘟病毒診斷技術在實際應用中具有較強的優勢，下述將通過實例應用與對比分析的方式，對設計的技術進行實踐檢驗。在此過程中，選擇某地區病毒防疫站作為實驗場所，由該防疫站內的專業技術人員參與此次診斷技術實驗檢測工作。為了保證實驗過程的安全性，避免實驗中所使用的病毒外泄，擾亂社會發展秩序，需要在防疫單位內搭建一個相對封閉的實驗場所，所有在場參與實驗的技術人員與工作人員需要穿著防護服進入實驗場所。完成實驗中的準備工作后，進行病毒血清與毒株的制備。選擇K-15第80代細胞毒株作為實驗樣品，此樣品在通過了國家衛生監督檢查防疫站認證后，在中國獸醫類藥品監察機構購買。在此基礎上，進行豬瘟病毒在實驗室內的繁殖與培養。培養過程中，將購買的毒株樣品細胞放置在培養器皿上，按照表1預設的實驗環境，進行實驗樣品的制備。

按照上述方式，進行實驗環境的布置，將細胞放置在上述環境中培養24小時，確保單層細胞覆蓋率達到85%以上時，使用專業的儀器設備，進行豬瘟病毒的提取。使用設計的診斷技術，對實驗樣本進行熒光測試，測試時長為15分鐘，熒光測試結果如圖2所示。

從上述圖2可以看出，熒光測試在5分鐘時，培養皿測試區域初步反應顯色；熒光測試在10分鐘時，培養皿測試區域顯色已較為明顯；熒光測試在15分鐘時，培養皿測試區域已完全顯示。由此可以證明設計的豬瘟病毒診斷技術具有對病毒的有效診斷效果。

完成上述實驗后，選擇基于CHO-K1技術的診斷技術作為傳統技術，對制備的樣本進行診斷與病毒檢測，記錄不同樣本的顯色時間，將培養皿測試樣本完全顯色作為指標，記錄從診斷開始到診斷結束，兩種不同診斷技術所需要的時長。將結果整理成表格，如表2所示。

從表2所示的實驗結果可以看出，技術診斷耗時小于傳統技術診斷耗時，證明在相同條件下，本文設計的診斷技術在實際應用中具有更高的診斷效率。綜上所述，得出此次對比實驗的結論：相比基于CHO-K1技術的診斷方法，筆者設計的豬瘟病毒診斷技術在實際應用中，可以有效縮短診斷耗時，將診斷所需時長控制在15分鐘范圍內。

三、結語

表1 豬瘟病毒實驗樣品制備環境與制備條件

表2 豬瘟病毒診斷技術耗時對比

筆者從豬瘟病毒的基因組序列分析、提取豬瘟病毒基因組蛋白結構、豬瘟病毒基因組RNA的熒光檢測與診斷三個方面，完成了豬瘟病毒的基因組學及診斷技術的研究。并選擇基于CHO-K1技術的診斷技術作為傳統技術，開展對比實驗研究，通過對比實驗證明，設計的豬瘟病毒診斷技術在實際應用中，可以有效縮短診斷耗時，將診斷所需時長控制在15分鐘范圍內。因此，可在后續的研究中，嘗試將設計的方法代替傳統的方法在臨床中使用，以此種方式解決我國動物產業在發展與建設中受到瘟疫干擾與抑制的問題。但要正式將此項技術廣泛推廣在市場，還需要對此方法進行多次實驗，從不同層面證明此項診斷的可行性。