基于轉錄組的糙蘇MYB 轉錄因子的挖掘及分析

熊勇 ,趙春艷 ,李曉艷

(1.云南民族大學 民族醫藥學院,云南 昆明 650500;2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221)

糙蘇 (PhlomisumbrosaTurcz.) 是唇形科(Labiatae) 糙蘇屬 (Phlomis) 的多年生直立草本植物,糙蘇的根和全草均可入藥,對腸胃炎、肺炎、咳嗽感冒具有療效,也可以用于治遼牛馬肺癰等[1]。糙蘇作為一種民間常用草藥,在其臨床及中成藥中的應用也在不斷擴大,糙蘇在化學成分、藥理作用及生藥學研究方面不斷深入,糙蘇中含有苯乙醇苷類、環烯醚萜類 (根)、黃酮類 (莖和葉)、萜類 (根和種子)、木質素 (地上部分) 及揮發油 (葉、花和籽) 等化學成分[2],但在其分子遺傳及基因組方面的研究報道不多。

轉錄因子 (transcription factors,TFs) 通過與目的基因的遠端和局部順式元件結合來調控基因表達,是在植物發育、細胞周期、細胞信號和逆境反應中發揮著重要作用的調節因子。典型的轉錄因子包括轉錄調控區、核定位信號區、寡聚反應區和DNA 結合區,這些功能區域決定了轉錄因子的結構和特征[3]。DNA 結合區的氨基酸序列高度保守,這些保守的氨基酸決定了轉錄因子與順式作用元件識別及結合的特異性。MYB 轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一,在植物生長發育、次生代謝調控、脅迫應答等生命活動中起著調控作用。MYB 轉錄因子是指以含有MYB 結構域為共同特征的一類轉錄因子,每個MYB 結構域都包含50～53 個氨基酸殘基高度保守的重復序列[4]。根據MYB 轉錄因子N 端保守的DNA 結構域的重復個數,把植物MYB 轉錄因子家族分為4 個亞類,1R-MYB (related-MYB)、R2R3-MYB、3R-MYB 和4R-MYB[5]。1R-MYB 亞類成員只含有一個MYB 結構域,可能是一類重要的端粒結合蛋白,在維持染色體結構的完整性和調節基因轉錄上起著重要作用。R2R3-MYB 亞類成員N 端含有兩個MYB 結構域,是成員最多的一個亞類,主要參與初級或次生代謝的調節,發育過程及對生物或非生物脅迫的響應[6-8]。3R-MYB 亞類成員的第一個保守色氨酸殘基 (W) 會被苯丙氨酸 (F)、異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)所取代[9]。4R-MYB 亞類成員的研究較少,只在少數的植物中進行表達[10]。

本研究以高通量測序技術構建轉錄組數據庫,利用生物信息學方法對糙蘇MYB 轉錄因子的理化性質、氨基酸序列及保守基序、高級結構、系統進化樹進行系統分析,并通過GO 注釋、蛋白質功能預測和表達模式進行深入分析,為進一步探究糙蘇MYB 轉錄因子家族基因的潛在功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 MYB 序列鑒定與理化性質分析

基于前期構建的糙蘇轉錄組測序數據庫,獲得糙蘇MYB 轉錄因子基因家族氨基酸序列,通過NCBI 的ORF finder 預測各個MYB 基因開放閱讀框,獲得完整的編碼蛋白序列,應用HMMER、Smart 和NCBI BLAST 與相應的蛋白數據進行蛋白相似性比對分析鑒定。

利用ExPASy-ProtParam 對糙蘇MYB 蛋白進行理化性質分析[11]。利用ProtComp 和SignalP 在線軟件對糙蘇MYB 蛋白進行亞細胞定位和信號肽進行預測。

1.2 MYB 序列保守結構域及系統發育樹分析

利用DNAMAN 8.0 對糙蘇MYB 轉錄因子進行氨基酸序列對比;利用Motif 分析工具MEME 數據庫對糙蘇MYB 進行保守基序分析。利用二級結構分析軟件SOPMA 對糙蘇MYB 轉錄因子編碼蛋白進行二級結構預測,并利用SWISS-MODEL 對不同亞類糙蘇MYB 轉錄因子進行三級結構建模。

從PlantTFDB 數據庫中下載擬南芥MYB 轉錄因子序列作為參考序列,利用MEGA 6.06 軟件內的Clustal W 程序,與糙蘇MYB 轉錄因子氨基酸序列進行對比分析,采用鄰接法 (Neighbor-joining method) 構建系統發育樹,參數設置P-distance、Bootstrap method 重復1 000 次,其他參數為默認值。

1.3 MYB 序列的功能分析和表達分析

通過糙蘇的高通量測序數據獲得基因的GO 注釋號,利用 QuickGO (https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/) 進行GO 注釋信息查詢,分析糙蘇MYB 轉錄因子蛋白GO 富集的功能注釋。以擬南芥作為參考,利用 STRING (https://string-db.org/) 的Muitipie sequence 對糙蘇MYB 轉錄因子蛋白進行蛋白質功能預測。依據MYB 基因家族根和葉的fpkm 值,通過Tbtools 軟件內置HeatMap 程序對糙蘇MYB 轉錄因子進行聚類分析并繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 MYB 序列鑒定與理化性質

從轉錄組數據庫中獲得68 條糙蘇MYB 堿基序列,通過HMMER、SMART 和NCBI BLAST 結構預測,去除重復序列及冗余轉錄本后,最終得到61 條具有MYB 保守結構域的序列,命名為PuMYB1～61,其中含11 個1R-MYB (related-MYB) 類轉錄因子,49 個 R2R3-MYB 類轉錄因子,1 個 4R-MYB(PuMYB38) 類轉錄因子。

ProtParam 對糙蘇MYB 轉錄因子家族一級結構的理化性質分析結果 (表1) 顯示,61 個糙蘇蛋白的氨基酸數目在98～1 756,平均分子量為38 608.20 u;61 個糙蘇蛋白中有25 個糙蘇蛋白的理論等電點大于7 (偏堿性),而有36 個小于7 (偏酸性),最小值為4.82 (PuMYB54),最大值為9.92 (PuMYB11),平均值為6.97;從不穩定系數來看,僅有2 個糙蘇蛋白 (PuMYB38、PuMYB51)的不穩定系數小于40 (穩定蛋白),而其他59 個均大于40 (不穩定蛋白),說明糙蘇MYB 轉錄因子家族整體是不穩定蛋白;糙蘇MYB 轉錄因子家族均為親水性蛋白,且熱穩定性較高,因為MYB家族蛋白的脂肪系數和總平均親水性GRAVY 均小于0。

表1 糙蘇MYB 轉錄因子家族蛋白理化性質

ProtComp 分析顯示,61 個糙蘇MYB 蛋白質中共有50 個定位在細胞核中,其余11 個MYB 成員定位在細胞核外。采用SignalP 對信號肽進行預測,61 個糙蘇MYB 蛋白質中,有5 個存在信號肽(PuMYB57、PuMYB58、PuMYB59、PuMYB60、PuMYB61),為分泌蛋白。

2.2 MYB 基因家族的結構

2.2.1 MYB 結構域

DNAMAN 對糙蘇MYB 轉錄因子基因進行氨基酸對比,并利用Jalview 軟件繪制R2、R3 結構域的氨基酸序列圖 (圖1)。有49 個糙蘇MYB 蛋白中有兩個保守的結構域R2 和R3,R2 保守基序類型為-[W] -X (19) -[W] -X (19) -[W] -,含有3 個高度保守的色氨酸殘基 (W),在這3 個色氨酸殘基之間分別間隔著包括相對保守的精氨酸(R)、脯氨酸 (P)、賴氨酸 (K)、谷氨酸 (E)、半胱氨酸 (C)、亮氨酸 (L) 等19 個氨基酸殘基序列。R3 保守基序類型為-[F] -X (18) -[W] -X (18) -[W] -,R3-MYB 的第一個保守色氨酸殘基 (W) 被苯丙氨酸 (F)、異亮氨酸(I) 或亮氨酸 (L) 等酸性氨基酸替代。以上結果表明,PuMYB 轉錄因子結構域具有高度保守性,轉錄因子N 端的重復序列可以很好地維持H (螺旋) -T (轉角) -H (螺旋) 結構,使轉錄因子與DNA 分子進行結合,控制糙蘇基因的轉錄水平,從而發揮特定功能。

圖1 糙蘇MYB 氨基酸序列的對比

2.2.2 MYB 轉錄因子的保守基序預測

使用MEME 預測61 個糙蘇MYB 家族成員的蛋白質的保守基序 (圖2)。E 值最低的預測保守基序motif 1 長度為50 個氨基酸,且有50 個PuMYB 家族成員有該基序;motif 2 長度為20 個氨基酸,有51 個PuMYB 家族成員有該基序;motif 3長度為21 個氨基酸,56 個PuMYB 家族成員都有該基序;motif 4 長度為11 個氨基酸,有32 個PuMYB 家族成員有該基序;motif 5 長度為11 個氨基酸,擁有該基序的PuMYB 家族成員有21 個;motif 6 長度為11 個氨基酸,擁有該基序的PuMYB家族成員有26 個;motif 7 長度為50 個氨基酸,有3 個PuMYB 家族成員有該基序;motif 8 長度為11個氨基酸,有13 個MYB 家族成員有該基序;motif 9 長度為33 個氨基酸,有4 個PuMYB 家族成員有該基序;motif 10 長度為23 個氨基酸,有6 個PuMYB 家族成員有該基序。另外motif 7 中具有3個極度保守的色氨酸 (W) 位點,2 個位點之間分別間隔19、18 個氨基 酸,在motif 1、motif 3、motif 4、motif 6、motif 10 中也都有W 位點。其中有26 個PuMYB 的基序排列為motif 3、motif 4、motif 1、motif 2。結合圖3,61 個糙蘇MYB 家族蛋白中都含有W 位點,說明PuMYB 轉錄因子基因結構域具有高度保守性。

圖2 糙蘇MYB 轉錄因子蛋白的保守基序預測

圖3 部分糙蘇MYB 轉錄因子家族成員的保守基序排列情況

2.3 MYB 轉錄因子家族高級結構

通過SOPMA 對糙蘇MYB 轉錄因子蛋白進行分析,結果為61 個PuMYB 中除PuMYB58 只有α-螺旋和無規則卷曲外,其余60 個PuMYB 都含有α-螺旋 (33.89%)、β-折疊 (7.45%)、β-轉角(4.60%) 和無規 則卷曲 (54.25%)。選取PuMYB1、PuMYB31、PuMYB38、PuMYB58 進 行展示 (圖4),說明PuMYB 以無規則卷曲構成二級結構的主要元件,α-螺旋為次要元件,而β-折疊和β-轉角所占的百分比較少。

圖4 糙蘇MYB 轉錄因子家族蛋白二級結構預測

選取3 個亞類中具有代表性的糙蘇MYB 轉錄因子蛋白進行同源建模 (Swiss-Model),得出PuMYB1、PuMYB31 是 SEQ 值為 59.09%、54.55%的R2R3 型MYB 的轉錄因子識別靶DNA的結構 (圖5),可知α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲共同構成了糙蘇MYB 蛋白的空間結構,與二級結構的預測結果相符。并且R2R3-PuMYB 類蛋白三級結構相似性較高,R2、R3 結構域中各有3 個α-螺旋,可以看到有HTH 結構的存在[12]。

圖5 PuMYB 蛋白三級結構的預測

2.4 MYB 基因家族的系統發育樹

基于MYB 家族蛋白共分為25 個亞組 (S1～25),其中S15、S5、S6、S10、S16、S12、S17 這7 個亞組中未發現PuMYB 家族蛋白,其余18 個亞組中均有PuMYB 家族蛋白分布。擬南芥MYB 家族蛋白中,S4、S5、S6、S7 亞家族參與花青素和黃酮類化合物的合成途徑,其中S4、S7 亞家族中的 ATMYB7、ATMYB11、ATMYB12、ATMYB111可以調控類黃酮類物質的生物合成[13]。所以,同這些蛋白處于同一分支的PuMYB40、PuMYB43 轉錄因子基因可能在黃酮類物質的生物合成中發揮重要調控作用[14]。

在植物抗逆性方面,擬南芥S1、S22 亞家族在響應非生物脅迫中起著一定的作用,與干旱脅迫和抗逆性有關[15-16],因此,與這些蛋白處于同一分支的PuMYB3、PuMYB44、PuMYB45、PuMYB57、PuMYB60、PuMYB61、PuMYB4、PuMYB19、PuMYB21、PuMYB27、PuMYB28 轉錄因子可能在響應非生物脅迫中起著一定作用[17]。擬南芥S2 亞家族ATMYB14、ATMYB15、ATMYB13 具有響 應冷脅迫和鹽脅迫的作用[18],與這些蛋白處于同一分支的PuMYB6、PuMYB53 轉錄因子可能具有類似功能。S11 亞家族的ATMYB102、ATMYB41 和ATMYB74 分別有助于植物對食菜青蟲產生抗性,并在鹽脅迫下起作用,參與不同細胞過程對滲透脅迫的反應,在同一分支下的PuMYB30 轉錄因子可能有類似功能。S20 亞家族的ATMYB2 控制ABA誘導鹽和脫水響應基因,ATMYB108 在生物和非生物脅迫中起作用,推測與這些蛋白處于同一分支的PuMYB7、PuMYB31、PuMYB42 轉錄因子也具有相似功能 (圖6)。綜上可知,PuMYB 轉錄因子基因可能參與糙蘇對生物與非生物脅迫的響應過程。

圖6 糙蘇與擬南芥MYB 家族蛋白的聚類分析

擬南芥S3 亞家族在擬南芥纖維和導管中激活木質素的生物合成,S21 亞家族能夠促進纖維細胞中細胞 壁的增 厚[19]。由此推 測,PuMYB48、PuMYB51、PuMYB9、PuMYB17、PuMYB56 可 能參與糙蘇木質素的生物合成以及細胞壁的增厚等次生生長過程。S14 亞家族是腋生分枝的部分冗余調節因子,且ATMYB38 在花序發育過程中影響附屬側芽的形成;ATMYB68 是根生長的特異性調節因子,在不利條件下影響植物的整體發育[20]。因此,與擬南芥S14 亞家族在同一分支的 PuMYB2、PuMYB29、PuMYB33、PuMYB50 可能會影響糙蘇附屬側芽和植物整體發育過程。

2.5 MYB 轉錄因子功能

2.5.1 MYB 轉錄因子的GO 注釋

通過QuickGO 在線查詢GO 注釋信息,糙蘇MYB 轉錄因子序列中分別有59 條、135 條和49 條注釋信息被分別注釋到生物學過程 (BP)、分子功能 (MF) 和細胞組分 (CC),共富集到16 個功能類別中,在生物學過程中,涉及細胞過程 (44)、生物調節 (7)、定位 (3)、發育過程 (1)、代謝過程 (1)、再合成 (1)、免疫系統過程 (1)、脅迫響應 (1) 等8 個功能類別,主要富集在細胞過程;在分子功能中,主要涉及結合 (83)、催化活性 (45)、轉錄因子活性 (5) 和分子轉導活性(2) 等4 個功能類別,主要富集在結合和催化活性上 (圖7);細胞組分中涉及細胞核 (39)、細胞膜 (2)、含蛋白復合物 (5)、病毒成分 (1)、胞外區 (1) 等5 個功能類別,主要表現在細胞核中富集。糙蘇MYB 轉錄因子的結合過程占比最大,MYB 轉錄因子主要通過結合到DNA 區域發揮相應的調控功能,主要涉及糙蘇的細胞過程和生物調節過程,以控制植物的生長過程[21]。

圖7 糙蘇轉錄因子的功能注釋

2.5.2 次生代謝相關MYB 轉錄因子功能

以擬南芥MYB 轉錄因子作為參考,通過STRING 數據庫的Muitipie sequence 分析預測糙蘇MYB 轉錄因子的蛋白功能,若同源性越高,功能相同或越相似。結果如表 2 所示,PuMYB7、PuMYB42 編碼蛋白與擬南芥轉錄因子AT3G06490.1 的同源性較高,推測它們參與了茉莉酸信號對雄蕊成熟和雄性育性的調節;PuMYB10、PuMYB34 轉錄因子推測是C4H 基因的轉錄抑制因子,參與了辛酸酯的生物合成,與擬南芥轉錄因子AT5G26660.1 同源性較高;推測與擬南芥轉錄因子AT5G49330.1 高度同源的PuMYB40轉錄因子參與黃酮醇的生物合成,主要控制黃酮醇在子葉和葉片中的生物合成;PuMYB43 轉錄因子與擬南芥轉錄因子AT4G38620.1 高度同源,與AT1G22640.1、AT2G16720.1 同源性較高,推 測PuMYB43 具有抑制肉桂酸4-羥化酶基因表達和抑制苯丙烷類生物合成基因表達的作用,并參與了黃酮醇生物合成的負調控,可見糙蘇MYB 轉錄因子參與了植物萜類代謝生物途徑[22]。

表2 糙蘇MYB 轉錄因子同源性較高的擬南芥MYB 轉錄因子蛋白功能

2.6 MYB 轉錄因子表達

利用Tbtools 軟件的HeatMap 功能對糙蘇MYB轉錄因子進行聚類分析并繪制熱圖(圖8),其中57個基因在根中表達,有15 個基因的表達量較高;56個基因在葉中表達,有10 個基因的表達量較高;有5 個基因在根和葉中的表達量都很高 (PuMYB18、PuMYB19、PuMYB21、PuMYB36、PuMYB43),44個基因在根中的表達量上調,17 個基因在葉中表達量上調;糙蘇黃酮類化合物主要在根中表達,糙蘇為多年宿生植物,民間用根入藥。PuMYB48、PuMYB51、PuMYB9、PuMYB17、PuMYB56 在以上系統進化樹分析中可能參與木質素的生物合成以及細胞壁的增厚等次生生長過程,且在根的表達量中上調,根據表達模式推測,這5 個基因可能參與糙蘇根木質素的生物合成和次生生長等過程。

圖8 糙蘇MYB 轉錄因子基因的表達熱圖

3 討論

MYB 類轉錄因子成員之間存在著機構和功能的相關性,根據這些相關性,可以在一定程度上預測一個MYB 類新成員的生物學功能。作為一類廣泛參與植物生命活動過程的轉錄因子,MYB 轉錄因子在次生代謝、非生物脅迫與植物激素應答、環境脅迫響應等方面發揮重要作用[27]。在擬南芥[28]、花生[29]、水稻、黑果枸杞[30]等植物中均已經鑒定出MYB 轉錄因子蛋白,并在基因水平上進行了深入分析。對糙蘇MYB 轉錄組進行研究,共篩選鑒定出61 個MYB 轉錄因子,氨基酸數目在98～1 756,可能是由于可變剪切導致了不同基因編碼區和非編碼區在基因全長的比例呈現多態性。糙蘇MYB 轉錄因子基因的高級結構預測表明,無規則卷曲構成糙蘇MYB 家族的主要元件,α-螺旋為次要元件。系統進化分析結果表明,在擬南芥的18 個亞組中發現糙蘇MYB 蛋白分布,PuMYB40、PuMYB43 可能參與糙蘇黃酮類物質的生物合成,有17 個PuMYB 轉錄因子可能在糙蘇抗逆性脅迫中發揮其作用,PuMYB48、PuMYB51、PuMYB9、PuMYB17、PuMYB56、PuMYB2、PuMYB29、PuMYB33、PuMYB50可能參與糙蘇的生長發育過程。

根據GO 注釋分析表明,糙蘇MYB 轉錄因子主要通過結合到DNA 區域發揮相應的調控功能,主要涉及糙蘇的細胞過程和生物調節過程,控制植物生長過程。糙蘇次生代謝相關MYB 轉錄因子功能分析表明,PuMYB7、PuMYB42 編碼蛋白與擬南芥轉錄因子AT3G06490.1 的同源性較高,推測有對茉莉酸信號響應的作用,可對雄蕊成熟和雄性育性進行調節;推測與擬南芥轉錄因子AT5G49330.1 高度同源的PuMYB40 轉錄因子參與黃酮醇的生物合成,主要控制黃酮醇在子葉和葉片中的生物合成;PuMYB43 轉錄因子可能具有抑制肉桂酸4-羥化酶基因表達和抑制苯丙烷類生物合成基因表達的作用,并參與黃酮醇生物合成的負調控。糙蘇MYB 轉錄因子表達分析顯示,PuMYB48、PuMYB51、PuMYB9、PuMYB17、PuMYB56 可 能參與糙蘇根的木質素的生物合成和次生生長等過程。