蝦血細胞虹彩病毒在青蝦中的感染情況調查分析

曾建剛 ,郭琦 ,沈中華 ,陳杰 ,劉莉?

(1.德清縣農業技術推廣中心,浙江 德清 313200;2.浙江省農業科學院 水生生物研究所,浙江 杭州 310021)

蝦血細胞虹彩病毒 (Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV) 又稱十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1),是雙鏈線性DNA 病毒,基因組大小約為166 kb,其病毒粒子呈二十面體,大小約為150 nm[1-3]。SHIV 最早于2014 年在浙江某凡納濱對蝦養殖場中被發現,并鑒定和命名[1]。目前已經證實,SHIV 可以感染凡納濱對蝦、中國明對蝦、脊尾白蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和日本沼蝦,感染SHIV 的凡納濱對蝦會出現厭食、胃腸道清空、肝胰腺顏色變淺和死亡的臨床癥狀[2-5]。

日本沼蝦 (Macrobrachiumnipponense) 俗稱河蝦或青蝦,是重要的淡水養殖品種,在眾多淡水養殖蝦種類中占有重要地位。德清被譽為 “青蝦之鄉”,日本沼蝦是其重要的特色養殖品種,是農民養殖增收的主要途徑[6]。近年在日本沼蝦的養殖中出現較為普遍的產量不如預期甚至育苗過程也不順利的現象,其中原因尚無報道。SHIV 在多種蝦中被檢測到,而對日本沼蝦養殖的危害未見相關研究。鑒于此,本研究對德清縣日本沼蝦養殖塘中SHIV 的流行情況進行監測,分析了蝦虹彩病毒感染青蝦的病理特征,相關結果為后續探討SHIV 對日本沼蝦養殖的影響奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020 年在德清縣設2 個采樣點,分別位于下渚湖街道和鐘管鎮,于7—10 月共采樣4 次,每次采集30 只以上青蝦。2021 年在德清縣設12 個采樣點,分別位于下渚湖、鐘管、新市、雷甸、新安和洛舍6 個鄉鎮或街道,于6、7 月分別進行采樣,每次各點采集30 只以上青蝦。

1.2 主要試劑和儀器

DNA 提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit (德國QIAGEN 公 司);PCR 反應試劑 (New England Biolabs 北京有限公司);引物由北京擎科生物科技有限公司合成。多樣品組織研磨儀 (上海凈信實業發展有限公司);PCR 儀 (北京東勝創新生物科技有限公司)。

1.3 樣品處理與DNA 提取

每個養殖戶取20 只以上的活蝦,解剖取每只蝦的肝胰腺至獨立的離心管中研磨成組織勻漿,或根據實驗需要混合解剖所得的肝胰腺,再研磨成組織勻漿,置于-40 ℃下保存。每個樣品取25 mg,利用基因組DNA 提取試劑盒提取DNA,提取方法參照試劑盒操作手冊。同時取樣用于單只檢測的蝦肝胰腺,采用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定,用于染色和電鏡觀察。

1.4 PCR 檢測

以1.3 中提取的DNA 為模板,以SHIV-F1(5′-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3′) 和SHIV-R1(5′-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3′) 進行巢式PCR 第一步擴增,反應體系為 2 × Master Mix 12.5 μL,10 μmol·L-1引物各0.5 μL,模板DNA 2.5 μL,ddH2O 9 μL。PCR 反應程序為95 ℃預變性3 min→95 ℃變性30 s→59 ℃復性30 s→72 ℃延伸30 s,共35 個循環,最后72 ℃延伸2 min。以第一步 PCR 的產物為模板,以SHIV-F2 (5′-CGGGAAACGATTCGTATTGGG-3′) 和SHIV-R2(5′-TTGCTTGATCGGCATCCTTGA-3′) 進行巢式PCR 第二步的擴增,反應體系為2×Master Mix 12.5 μL,10 μM 引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR 反應程序為95 ℃預變性3 min→95 ℃變性30 s→59 ℃復性30 s→72 ℃延伸20 s,共35 個循環,最后72 ℃延伸2 min,反應完畢后進行瓊脂糖電泳分析。

1.5 肝胰腺的石蠟切片制作及HE 染色

將肝胰腺切割成1 mm 見方的組織塊,在4%多聚甲醛中進行固定,使用不同濃度的乙醇和二甲苯對固定好的組織依次進行脫水和透明,浸蠟包埋后進行切片,將石蠟切片展平烘干后使用二甲苯脫蠟,并用不同濃度的乙醇逐級復水。分別用蘇木素(Hematoxylin) 和伊紅 (Eosin) 進行染色,隨后將切片依次放入無水乙醇和二甲苯中進行脫水及透明,用中性樹膠封片,通過光學顯微鏡觀察,并采集圖像進行分析。

1.6 透射電鏡觀察

將肝胰腺切割成1 mm 見方的組織塊,在2.5%戊二醛固定液中于4 ℃固定過夜;棄去戊二醛固定液,加入足量磷酸緩沖液漂洗3 次,加入0.1 mol·L-1四氧化鋨溶液固定2 h;棄去鋨酸固定液,加入足量磷酸緩沖液漂洗3 次后,樣品依次在50%、70%、80%、90%、95%的乙醇中進行梯度脫水,用無水乙醇脫水處理3 次,再在丙酮中脫水3 次。樣品在丙酮與包埋劑1∶1 配置液中滲透1 h,在丙酮與包埋劑1∶3 配置液中滲透3 h,最后在純包埋劑中滲透過夜。將樣品加入純包埋劑中,于70 ℃烘箱中加熱聚合48 h。取出聚合完成的樣品切片,用銅網吸附后置于透射電鏡下觀察,并采集圖像。

2 結果與分析

2.1 日本沼蝦中SHIV 的PCR 檢測結果

2020 年在德清縣2 個日本沼蝦養殖戶進行為期4 個月的病原跟蹤監測,結果表明,日本沼蝦中存在感染SHIV 的情況。表1 顯示,在SHIV DNA的巢式PCR 檢測中,7 和10 月養殖戶A 和B 的日本沼蝦樣品的SHIV 檢測結果均呈陽性;8 和9 月分別在養殖戶A 和B 的日本沼蝦樣品中檢測到SHIV 的特異性核酸片段。2021 年在對德清地區6個行政村12 個養殖戶的日本沼蝦的檢測中發現(表2),有6 個養殖戶的日本沼蝦的SHIV 呈陽性。進一步選取其中3 個養殖戶再次采樣,分別提取單只蝦的DNA 進行巢式PCR 檢測,結果顯示,日本沼蝦SHIV 的感染率在10%～20%。

表1 不同采樣時間下日本沼蝦中SHIV 的PCR 檢測結果

表2 不同養殖戶的日本沼蝦中的SHIV 的PCR 檢測結果

2.2 SHIV 對日本沼蝦肝胰腺組織結構的影響

肝胰腺的HE 染色結果顯示,SHIV 檢測為陰性的日本沼蝦肝胰腺的細胞結構正常,分布較為均勻;SHIV 檢測為陽性的日本沼蝦肝胰腺中分泌細胞和內部轉運泡數量增加,儲存細胞數量有所減少,管腔體積變大,存在核固縮現象 (圖1)。

圖1 感染SHIV 對日本沼蝦肝胰腺顯微結構的影響

2.3 日本沼蝦肝胰腺組織中SHIV 的電鏡觀察

分別取SHIV 的巢式PCR 結果為陰性和陽性的日本沼蝦肝胰腺包埋并切片后,在透射電鏡下進行觀察。SHIV 為陰性的肝胰腺細胞中未觀察到病毒粒子 (圖2 中A、B)。在SHIV 檢測為陽性的日本沼蝦肝胰腺中,觀察到直徑約為150 nm 類似病毒粒子的結構,顯示SHIV 能夠感染日本沼蝦的肝胰腺,并進入其細胞質 (圖2 中C～F)。

圖2 日本沼蝦肝胰腺肝小管上皮細胞內SHIV 的病毒粒子

3 討論

蝦血細胞虹彩病毒發現至今未滿10 a,由全國的SHIV 監測結果可知,目前已在浙江、廣東、河北、江蘇等省市及沿海地區的對蝦養殖場中檢測到SHIV[1,7]。浙江德清縣被譽為 “青蝦之鄉”,日本沼蝦是該地區主要的養殖品種。2020 和2021 年的調查結果顯示,SHIV 在德清地區的日本沼蝦中普遍存在。其中,2020 年的養殖戶A 和2021 年的養殖戶1 為同一家,其SHIV 的檢測結果在跟蹤調查中均為陽性,顯示SHIV 可以一直存在于養殖塘中,可能對日本沼蝦的養殖產生威脅。德清縣的青蝦養殖一般采用人工培育幼蝦的方式,在5 月初選擇懷卵量大且較為健壯的親蝦至繁殖池塘中,待幼蝦孵出20 d 后,再捕出放養,在之后的1 a 內捕大留小,產量和經濟利潤較為可觀[8]。然而這種模式缺乏對親蝦的病原篩查,養殖時間較長,容易造成病毒傳播。本研究在2021 年5—6 月及2020 年7—10 月的病原監測中均檢測到SHIV 的存在,提示該模式可能存在使病毒擴散的風險。

目前對SHIV 的研究主要集中在凡納濱對蝦上,在患病蝦組織切片中可以普遍觀察得到嗜酸性包涵體和核固縮現象。透射電鏡觀察顯示,患病蝦的肝胰腺、造血組織、肌肉、步足和游泳足中均存在SHIV 病毒粒子,其大小約為150 nm,呈典型的二十面體形狀[1]。通過投喂和反向灌腸SHIV,可使凡納濱對蝦累積死亡率高達100%[1];通過注射感染可使脊尾白蝦的累積死亡率達到76%,通過投喂感染的死亡率也可達到50%[5],因此,SHIV已成為我國對蝦養殖的重大威脅之一。本研究在通過巢式PCR 檢測到SHIV 的日本沼蝦肝胰腺組織切片中觀察到核固縮現象,透射電鏡觀察顯示,SHIV 陽性蝦的肝胰腺中存在類似SHIV 病毒粒子的結構,大小約為150 nm,主要存在于細胞質中。有研究表明,日本沼蝦感染SHIV 后的病毒載量顯著低于羅氏沼蝦和凡納濱對蝦,這可能是SHIV 對日本沼蝦的影響較為有限的原因[4]。本研究僅對采樣的蝦進行HE 染色和透射電鏡觀察,初步探討了SHIV 對日本沼蝦的影響,要明確SHIV 與日本沼蝦患病的關系,還需進行更深入的研究。

日本沼蝦中常見的病害主要有固著類纖毛蟲病、霉菌病、絲狀細菌病、紅體病、黑鰓病等[9]。感染SHIV 的日本沼蝦的肝胰腺存在一定程度的病變,可能會影響其正常代謝功能,從而引起感染SHIV 的日本沼蝦對其他病原的抵抗力降低,導致更易受寄生蟲或細菌性病害的影響。蝦類病害的發生與養殖環境和氣溫變化有關。有研究發現,水質中的總氮和水溫對SHIV 在凡納濱對蝦中的發病情況具有較大的影響[10]。因此,注意日本沼蝦的親蝦育種過程中的病害監測工作,加強青蝦養殖過程中的水質條件管理,重視對病害的預防,能有效降低SHIV 對日本沼蝦養殖的影響。