HPLC法測定腎復康Ⅱ號膠囊中5個成分的含量Δ

尹繼瑤，沈霞，胡靜，崔小敏，任慧，曲彤，李寧，屈凱，3#a，陳志永，#b（.陜西中醫藥大學基礎醫學院，陜西 咸陽 7083；.陜西省中醫藥研究院，西安 70003；3.陜西省中醫醫院腎病二科，西安 70003）

腎復康Ⅱ號膠囊（陜藥制字Z20130011）為陜西省中醫醫院的醫療機構制劑，由山茱萸、菟絲子、熟地黃、淫羊藿、金櫻子、赤芍、丹參、黃芪、山藥、王不留行、姜黃、醋鱉甲12味中藥組成；其作為防治腎小球硬化的有效方劑，臨床療效顯著[1－4]。方中山茱萸能壯元氣，功專補陽固陰，菟絲子可溫腎固精，二者共為君藥；熟地黃能滋陰填髓，淫羊藿、金櫻子可溫腎壯陽，三者均能助君藥補腎之力；丹參、赤芍、姜黃能活血化瘀、散體內凝滯之血，黃芪、山藥可補益脾氣以養腎，王不留行、醋鱉甲可活血通經而散結；諸藥合用，共奏益腎散結之效。

本課題組的前期研究結果顯示，腎復康Ⅱ號膠囊組方及拆方均可調節Notch信號通路相關蛋白表達，從而抑制腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cells，GMCs）的晚期凋亡，有效改善腎小球硬化癥[3]；同時，其組方可抑制腎組織中纖溶酶原激活物抑制劑1和轉化生長因子 β1的表達，從而對抗腎間質纖維化的發生[1，5－7]；此外，腎復康Ⅱ號膠囊亦可作用于肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受體間質表皮轉化因子（c-mesenchymal-epithelial transition factor，c-Met），調控間充質干細胞的旁分泌功能，起到改善腎功能的作用[8]。為提高腎復康Ⅱ號膠囊的質量控制水平，本研究選取該制劑中各組方藥材在2020年版《中國藥典》（一部）[9]中的質量控制成分，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定山茱萸中的莫諾苷、馬錢苷，赤芍中的芍藥苷，丹參中的丹酚酸B和淫羊藿中的淫羊藿苷含量，首次建立了該制劑的含量測定方法，以期保障其臨床使用的有效性和安全性。

1 材料

1.1 主要儀器

Agilent 1260系列HPLC儀系統（包括VWD檢測器和Agilent Chem Station工作站）購自美國Agilent公司；KQ-100型超聲波清洗機購自昆山超聲儀器有限公司；BS210S型電子分析天平（d＝0.1 mg）、BT25S型電子分析天平（d＝0.01 mg）均購自北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

腎復康Ⅱ號膠囊由陜西省中醫醫院生產，規格為0.3 g×45粒/瓶，批號分別為20201101、20201110、20210724、20210929、20211013。莫諾苷對照品（批號P11M11F2846，純度≥98.0%）、馬錢苷對照品（批號P24O11F128801，純度≥98.0%）、丹酚酸B對照品（批號P13N11F130912，純度≥98.0%）均購自上海源葉生物科技有限公司；芍藥苷對照品（批號MUST-17031901，純度≥99.3%）購自成都曼斯特生物科技有限公司；淫羊藿苷對照品（批號0737-200111，純度≥98.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，10%A→20%A；20～30 min，20%A→30%A；30～40 min，30%A→40%A）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測波長為240 nm；進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷對照品各適量，置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋并定容，即得含莫諾苷0.240 mg/mL、馬錢苷0.242 mg/mL、芍藥苷0.350 mg/mL、丹酚酸B 0.236 mg/mL、淫羊藿苷0.259 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取腎復康Ⅱ號膠囊內容物，研細，精密稱取0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶100（g/mL）加80%甲醇50 mL使之溶解，稱定質量；超聲（頻率40 kHz，功率300 W）處理30 min，冷卻至室溫，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻；經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照處方制劑工藝，分別制得缺山茱萸、缺赤芍、缺丹參和缺淫羊藿的陰性樣品，再分別按“2.2.2”項下方法制備各陰性樣品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取上述供試品溶液、混合對照品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。由圖1可知，腎復康Ⅱ號膠囊中莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷均能達到有效分離，理論板數分別為20 522、52 856、55 345、347 545、259 194，分離度分別為1.63、1.72、2.80、2.77、2.69，陰性樣品無干擾，表明該方法系統適用性良好。

圖1 腎復康Ⅱ號膠囊中5個成分的HPLC圖

2.4 線性關系、定量限和檢測限考察

精密量取上述混合對照品溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL，用80%甲醇分別定容至10 mL容量瓶中，再按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積。以對照品的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得到5個成分的回歸方程、相關系數（r）和線性范圍，結果見表1。再以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限和檢測限，求得莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的定量限分別為0.166、0.198、0.877、0.220、0.260 μg/mL，檢測限分別為0.056、0.066、0.292、0.073、0.086 μg/mL。

表1 5個成分的線性回歸考察結果

2.5 精密度考察

取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄各成分峰面積。結果顯示，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.42%、0.54%、1.62%、0.38%和0.23%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性考察

取同一批腎復康Ⅱ號膠囊（批號20201101）制備的供試品溶液，室溫存放，分別于0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積。結果顯示，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.65%、2.03%、0.62%、0.36%和2.36%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.7 重復性考察

取同一批腎復康Ⅱ號膠囊（批號20201101），共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積，以外標法計算樣品中5個成分的含量。結果顯示，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷含量的RSD分別為1.66%、2.36%、1.09%、0.17%和1.45%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.8 準確度考察

精密稱取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷對照品各適量，加80%甲醇溶解并稀釋，制成上述5個成分質量濃度依次為1.000、0.816、2.984、2.860、0.616 mg/mL的單一對照品溶液。精密稱取已知5個成分含量的腎復康Ⅱ號膠囊（批號20201101）內容物約0.25 g，共6份，精密加入各單一對照品溶液，再按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液后，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算各成分的平均加樣回收率，結果表明方法準確度良好，詳見表2。

2.9 樣品含量測定

取5批腎復康Ⅱ號膠囊，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積，以外標法計算樣品中5個成分的含量，每批樣品平行測定3次，結果見表3。

表3 莫諾苷等5個成分的含量測定結果（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 指標成分的選取

現代藥理研究證實，山茱萸中的莫諾苷可通過晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end products，AGEs）-AGE受體（receptor of AGE，RAGE）信號通路抑制RAGE、核因子κB蛋白和絲裂原激活蛋白激酶的表達，減輕氧化應激損傷，從而起到對腎損傷的改善作用[10]；山茱萸中的馬錢苷可有效調節AGEs誘導GMCs產生的內質網應激，減輕炎癥反應，抑制氧化應激，從而改善腎功能[11－12]；赤芍中的芍藥苷可以通過抑制硫氧還蛋白結合蛋白的表達而拮抗氧化應激對GMCs的損傷，從而發揮腎臟保護作用[13－14]；丹參中的丹酚酸B可通過抗糖[15]、抗炎[16]、控制氧化應激[17]等途徑減輕腎功能損傷；淫羊藿中的淫羊藿苷可通過免疫調節等作用改善腎功能[18]。以上5個成分均有良好的腎臟保護作用，且均為2020年版《中國藥典》（一部）中各藥材的質量控制成分[9]，因此，本研究選取其作為腎復康Ⅱ號膠囊的質量控制指標成分。

3.2 供試品溶液制備方法的考察

為優化供試品溶液的制備方法，本研究分別考察了提取溶劑（乙醇、甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇）、提取方式（超聲提取、加熱回流提取）、提取時間（15、30、45 min）、料液比（1∶50、1∶100、1∶150，g/mL）、提取次數（1、2、3次）對提取效果的影響，最終確定的制備方法為：以80%甲醇為提取溶劑，料液比為1∶100（g/mL），超聲提取1次，提取30 min。

3.3 色譜柱和流動相等色譜條件的考察

本研究考察了月旭XB-C18、Agilent 5 TC-C18這2種色譜柱對指標成分峰形的影響，結果發現，利用這2種色譜柱所得5個成分的峰形相近，即兩者均可用于腎復康Ⅱ號膠囊的含量測定。同時，還考察了不同柱溫（25、30、35℃）對5個成分分離度的影響，結果發現，5個成分在30℃時的分離效果最佳，故最終選擇Agilent 5 TC-C18色譜柱，并將柱溫設置為30℃。

本研究考察了甲醇-磷酸溶液、甲醇-甲酸溶液、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液等流動相系統，并考察了不同濃度（0.1%、0.3%）的甲酸、磷酸對5個成分分離度的影響。結果顯示，采用乙腈作為流動相系統時，色譜峰基線較平穩、分離度較好；甲酸和磷酸的濃度對最終的分離效果影響不大，但磷酸的分離度優于甲酸，故最終選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。

3.4 檢測波長的選擇

由2020年版《中國藥典》（一部）[9]及相關文獻可知，上述5個成分的最佳檢測波長不同，最大吸收在230～270 nm之間。本研究考察了230～270 nm之間不同波長（230、240、260、270 nm）下各成分的出峰情況，結果發現在240 nm波長下各成分分離度較高、峰形較好，故以240 nm為檢測波長。

綜上，本研究選取了腎復康Ⅱ號膠囊中含量較高且與其臨床藥效緊密相關的5個成分作為指標成分，首次建立了該制劑的多指標含量測定方法。該方法簡便、準確、重復性好，有助于提升腎復康Ⅱ號膠囊的質量控制水平，保證其臨床應用的有效性和安全性。