高效液相色譜-串聯質譜法測定禽肉中氟吡菌酰胺殘留量的研究

朱亞瓊

品測(上海)檢測科技有限公司， 上海 201108

我國是世界上最大的農業國之一，據《2021年國民經濟和社會發展統計公報》報道，全年糧食類種植面積達到11 763萬公頃，比上年增加86萬公頃。中國在農藥使用量和生產量上都位居世界第1位[1]。近年來，農藥品種不斷增多，大量的農藥施于農田，給農產品造成直接污染的同時，一部分殘留在人類賴以生存的生態環境中，殘存于土壤、水源、大氣以及農作物中，對人類、家畜(動物性食品)及環境產生負面影響[2]。氟吡菌酰胺是一種琥珀酸脫氫酶抑制劑，它可以選擇性地抑制線蟲線粒體中的呼吸鏈復合體Ⅱ，從而導致線蟲死亡，具有低毒安全，殺菌譜廣等特點，既可用于防治灰霉病、白粉病、菌核病以及念珠菌屬引起的病害，又對線蟲有較好的防治作用[3]。國標GB 2763—2021[4]對動物源性食品中氟吡菌酰胺制定了限量要求，但目前尚未出臺針對動物源性食品中氟吡菌酰胺的檢測方法或相應的研究報道，因此亟需開展一種高效、簡便，同時能夠準確地定性和定量的檢測方法。本文以禽肉為研究對象，優化提取溶劑和凈化方法，比較了2種檢測器的靈敏度，得到適用于禽肉基質的檢測方法。

目前有大量文獻針對植物源性食品中氟吡菌酰胺檢測的相關研究。其中提取溶劑一般選擇：乙腈、酸化乙腈、乙酸乙酯、丙酮和正己烷等，凈化方式大多使用QuEChERS，檢測器為氣相色譜-串聯質譜儀或超高效液相色譜-串聯質譜儀[5-7]。本文參考相關研究的結論，結合禽肉基質特性，優化出適用于禽肉基質中氟吡菌酰胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

氟吡菌酰胺標準品(純度99.9 %，北京曼哈格生物科技有限公司)；乙酸乙酯、乙腈、正己烷、甲酸(色譜純，上海安譜科技股份有限公司)；超純水(自制)；無水硫酸鈉(分析純，國藥)；N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)(粒徑范圍：40 μm～60 μm，平均孔徑：100 ?，上海安譜科技股份有限公司)；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)(粒徑范圍：40 μm～60 μm，平均孔徑：60 ?，上海安譜科技股份有限公司)。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯質譜儀(型號I Class/5500，配有ESI源，美國沃特世公司/AB SCIEX)；氣相色譜串聯質譜儀(型號8890/7000D，配有EI源，美國安捷倫公司)；高速冷凍離心機(型號HR21M，湖南赫西儀器裝備有限公司)；電子天平(型號ME204，梅特勒托利多科技(中國)有限公司)；超聲機(型號SB25-12D，寧波新芝生物科技股份有限公司)；氮吹儀(型號Xce/Vap，美國Horizon公司)；渦旋振蕩器(型號Multi reax，德國HEIDOLPH公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1檢測器的選擇

將GC-MS/MS和LC-MS/MS的儀器參數調試到最佳響應狀態，將濃度為1.0 ng/mL的氟吡菌酰胺標準溶液上機，比較兩種檢測器的信噪比與精密度，選擇相同濃度條件下信噪比大且響應值穩定的檢測器。

1.3.1.1GC-MS/MS儀器條件

色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣方式：不分流進樣；載氣(氦氣)流速：1.0 mL/min；進樣量：1.0 μL；升溫程序見表1；進樣口溫度：280 ℃，傳輸管溫度：280 ℃。監測方式：MRM；氟吡菌酰胺特征離子：173/145(定量離子)，173/95(定性離子)。

表1 氣相色譜儀升溫程序

1.3.1.2LC-MS/MS儀器條件

色譜柱：BEHC18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)、乙腈(B)；洗脫方式：梯度洗脫，見表2；離子源：電噴霧離子源ESI+；離子化電壓：5000 V；去溶劑溫度：550 ℃；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；氣簾氣：20 psi；監測方式：MRM；氟吡菌酰胺特征離子：397/173(定量離子)，397/208(定性離子)，進樣體積：2.0 μL。

表2 梯度洗脫比例

1.3.2標準曲線的選擇

因禽肉基質復雜，在電離過程中目標物易受雜質干擾，導致離子化效率或高或低。為驗證基質效應的影響，實驗準備了4種禽肉基質曲線與溶劑配制的曲線上機檢測，觀察其基質效應。具體方法為：溶劑曲線：用乙腈將氟吡菌酰胺稀釋成濃度為0.5 ng/mL，1.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL和50 ng/mL的系列工作曲線；基質曲線：分別移取一定體積的標準溶液至空白基質提取液中，45 ℃水浴氮氣吹近干，加入乙腈1.0 mL，渦旋復溶，配制成和溶劑曲線一致的濃度上機測試。

1.3.3提取溶劑的選擇

按照氟吡菌酰胺的物理性質，其在水中溶解度較低，易溶于有機溶劑。實驗分別采用乙腈、1%甲酸乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑，比較3種溶劑的提取效率。具體步驟：稱取4種禽肉試樣(雞肉、鴿肉、鴨肉和鵝肉)各2 g(精確至0.001 g)，置于50 mL離心管中，分別加入10 mL提取溶劑和5 g無水硫酸鈉，振蕩5 min后超聲10 min，以8 000 r/min離心10 min，取出上清液，殘渣加入10 mL提取溶劑再次提取，合并提取液于45 ℃水浴氮吹近干，加入2.0 mL乙腈溶解，3.0 mL乙腈飽和正己烷去脂，離心，去除正己烷，取乙腈層過0.22 μm濾膜上機檢測。

1.3.4凈化方法的選擇

國內外農藥殘留主要凈化方法有：SPE、GPC和QuEChERS，凈化試劑：無水硫酸鈉、石墨化碳黑(GCB)、氨基(NH2)、PSA、弗羅里硅土和C18等。本文研究對象為禽肉，試驗用QuEChERS方法凈化，根據禽肉的特性，選擇無水硫酸鈉、PSA和C18為凈化劑。其中無水硫酸鈉能去除水份；PSA用于消除各種有機酸、脂肪酸、糖類和部分色素的影響；C18可吸附油脂和非極性雜質。本實驗將考察PSA、C18的用量與回收率的關系。

2 結果與討論

2.1 檢測器的選擇、曲線范圍和檢出限

將氟吡菌酰胺配制為1.0 ng/mL，在GC-MS/MS和LC-MS/MS上測試10次，由軟件計算得到的信噪比的平均值以及相對標準偏差數據見表3。

表3 GC-MS/MS和LC-MS/MS不同濃度下信噪比

以上數據可知，同一濃度下LC-MS/MS上的信噪比比GC-MS/MS上的信噪比大且相對標準偏差較小，因此LC-MS/MS上的靈敏度和精密度優于GC-MS/MS。故后續實驗選擇LC-MS/MS進行測試。

實驗發現當氟吡菌酰胺濃度在0.5 ng/mL時，LC-MS/MS上的信噪比和精密度滿足實驗要求，結合基質效應的影響，以0.5 ng/mL為基質曲線的最低點濃度。當氟吡菌酰胺濃度高于50 ng/mL時，在LC-MS/MS上的響應過載，線性相關系數不能滿足要求。因此線性范圍定為：0.5 ng/mL ～50 ng/mL，相關系數在0.99以上。取陰性基質提取液重復進樣20次，計算出噪聲的標準偏差Sb，按公式CL儀器=3×Sb/b(b：標準曲線斜率)，得出儀器的檢出限。用儀器的檢出限除以稱樣量，乘以稀釋倍數，綜合考慮基質效應，最終確定LOD(檢出限)為0.5 μg/kg。

圖1 氟吡菌酰胺標準溶液的質譜圖(濃度：0.5 ng/mL)

2.2 標準曲線的選擇

基質效應與基質的種類有關，農藥結構、濃度以及檢測器及進樣方式也會對基質效應產生影響[8]，通常表現為使目標物質信號降低或增強。用基質標準曲線的斜率除以溶劑標準曲線的斜率來表示基質效應(Me)的大小。具體公式如下。

當Me為負值時表示存在基質抑制效應，Me為正值時表示存在基質增強效應；絕對值越大則基質效應越強，如恰好為0則表示不存在基質效應[9]。實驗采用4種陰性禽肉基質(雞肉、鴿肉、鴨肉和鵝肉)配制成基質標準曲線和乙腈配制的溶劑標準曲線上機測試，其相關系數、斜率和Me值見表4。

表4 不同溶劑配制的標準曲線方程及斜率、相關系數和Me

從Me值得知，禽肉中存在一定的基質效應，且4種禽肉之間的斜率較為接近，即基質干擾較為相似。由此得出，禽肉中含有相似雜質對氟吡菌酰胺的離子化效率產生干擾，對其響應產生抑制作用。故后續實驗選擇空白基質標準曲線作為定量依據。

2.3 提取溶劑的選擇

實驗用雞肉、鴿肉、鴨肉和鵝肉在1.0 μg/kg 、2.0 μg/kg 、5.0 μg/kg濃度處加標，分別用乙腈、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈提取，每個濃度做6平行，計算出平均回收率，其數據見圖2-圖5。

圖2 雞肉基質中3種提取溶劑的回收率

圖3 鴿肉基質中3種提取溶劑的回收率

圖4 鴨肉基質中3種提取溶劑的回收率

圖5 鵝肉基質中3種提取溶劑的回收率

由上圖可得，1%甲酸乙腈在4種禽肉基質中的平均回收率均高于乙腈和乙酸乙酯提取的回收率。故提取溶劑選用 1%甲酸乙腈。

2.4 凈化方式的選擇

通過加標回收實驗(加標濃度：10 μg/kg)，在C18粉末用量為100 mg的條件下，測試加入不同質量的PSA粉末(0 mg、25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg和200 mg)對4種禽肉基質的凈化效果，觀察回收率的變化。實驗數據見圖6。

圖6 PSA不同用量的回收率

圖6表明 ，PSA的用量在0 mg ～125 mg時回收率均為增長趨勢，當用量在125 mg ～200 mg時回收率無明顯增長。為節省成本，將PSA用量定為125 mg。

在PSA粉末用量為125 mg的條件下，測試用不同質量的C18粉末(0 mg、25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg和200 mg)對4種禽肉基質凈化效果，比較其回收率。實驗數據見圖7。

圖7 C18不同用量的回收率

圖7可得 ，C18用量在0 mg ～150 mg時回收率均為增長趨勢，但C18用量在150 mg ～200 mg時回收率程下降趨勢。C18用量為150 mg時回收率最佳。

2.5 檢測方法的驗證

試驗結果表明：用1%甲酸乙腈提取，使用125 mg PSA以及150 mgC18凈化，LC-MS/MS檢測為禽肉中氟吡菌酰胺最佳檢測方法。通過加標回收對該方法進行驗證，結果如表4所示。

表4 方法優化后測得的氟吡菌酰胺的回收率和相對標準偏差(n=6)

使用最佳前處理方法得到的回收率范圍在87.5%～96.4%之間，相對標準偏差2.5%～7.7%，能夠滿足日常農藥殘留檢測的需求。

3 結論

本文建立了1%甲酸乙腈提取、QuEChERS凈化、高效液相色譜-串聯質譜測定禽肉中氟吡菌酰胺殘留量的檢測方法。采用MRM模式掃描，基質標準曲線外標法定量。考察了線性范圍、基質效應，確定了檢出限，驗證了回收率與精密度，各項參數均符合實驗室檢測要求。本文對動物源性食品中氟吡菌酰胺檢測的研究起到積極的作用。