LC-MS/MS測定乳粉中高氯酸鹽的不確定度影響因素的探討

朱建新

上海德諾產品檢測有限公司， 上海 200436

高氯酸鹽是一種化學性質穩定、潛在毒性大的有毒物質，主要用于各種工業和軍事應用，包括硝酸鹽肥料、固體火箭燃料、彈藥、炸藥、煙花、道路照明彈和安全氣囊[1]。接觸高氯酸鹽的主要途徑是攝入受污染的飲用水或用受污染的水種植的食物[2]。高氯酸鹽最終通過食物鏈進入人體，抑制人體對碘化物甲狀腺的攝取[3],持續吸入導致甲狀腺功能退化，影響人體發育。高氯酸鹽已在多種食物中檢測到，包括水果、蔬菜和谷物，以及乳制品和母乳[4]，奶粉中含有高氯酸鹽，主要來源可能是在加工過程中使用了含氯的自來水或消毒劑以及包裝材料的遷移。目前，加拿大衛生部只規定了“飲用水中高氯酸鹽的篩選值為0.004 mg/L (4 μg/L)”[5]。歐盟委員會在2020年5月20日發布(EC)2020/685號條例，補充規定了五類食品的高氯酸鹽限量，其中嬰兒幼兒配方奶粉、特殊醫學用途嬰幼兒配方食品為0.01 mg/kg；嬰兒食品為0.02 mg/kg；加工谷類食品為0.01 mg/kg[6]。雖然我們國家還未制訂食品中的高氯酸鹽限量標準, 但監測奶粉中的高氯酸鹽含量仍然十分必要。

測量不確定度作為測量結果的一部分，合理表征了被測量量值的分散性，對測量結果的可信性、可比性和可接受性都有重要影響，是評價測量活動質量的重要指標[7]。測量不確定度的大小反映了測量結果的質量高低，不確定度越小，表明測量結果與被測量的真值愈接近，使用價值越高；反之，其使用價值也越低。測量結果的完整性應包括測量不確定度，對不確定度分量進行計算并評定，確定測定乳粉中高氯酸鹽的方法中不確定度的主要影響因素，從而為提高檢測結果的準確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(CH3CN)、甲醇(CH3OH)、甲酸(HCOOH)(色譜純，默克)；乙酸(CH3COOH)(色譜純)；甲酸銨(HCOONH4)、乙酸銨(CH3COONH4)(液質聯用級)；超純水(H2O)(電阻率為18.2 MΩ·cm)；高氯鈉鹽標準品(1 000 μg/mL)；高氯酸鹽內標(100 μg/mL，美國劍橋提供，CILOLM-7310-1.2)；PRiMEHLB固相萃取柱(Waters公司)；全脂乳粉。

1.2 儀器與設備

G7120A-G6470B液-質聯用儀(安捷倫公司)；渦旋混合器(其林貝爾儀器公司)；勻漿機(Fluko)；離心機(Joucun)；電子天平(METTLER TOLEDO)；恒溫水浴振蕩器(泰仕特儀器(中國)有限公司)。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱：AcclaimTrinity P1離子交換柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相：A為乙腈，B為20 mmol/L乙酸銨溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5.0 μL。質譜條件：離子源：ESI源；檢測方式：MRM；掃描方式：負離子模式；毛細管電壓：200 V；錐孔壓：60 V；溶劑脫溫：500 ℃；脫溶劑氣流量：1000 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；用MRM模式采集數據；高氯酸鹽定性離子85.0、99.0、101.0，定量離子83.0；內標高氯酸根定性離子107.0，定量離子89.0。

1.4 樣品測定

1.4.1稱樣：稱取乳粉試樣2 g(精確至0.000 1 g)于50 mL離心管中，加入150 μL內標溶液。

1.4.2提取：上述樣品中加入5.0 mL 0.1%乙酸水溶液，迅速混勻，于45 ℃水浴超聲20 min，振蕩5 min，再加入10.0 mL甲醇，混勻，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，凈化。

1.4.3凈化：吸取約3.0 mL上述上清液，過固相萃取柱及0.22 μm再生纖維素濾膜，棄去約1 mL流出液，收集續濾液，供上機測定。

1.4.4配制標準曲線：取0.1 mL高氯酸鹽標準儲備液(1 000 μg/mL)，于100 mL容量瓶中，超純水定容，制成1.0 μg/mL高氯酸鹽使用液。

吸取0 μL、10 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 000 μL高氯酸鹽使用液(1.0 μg/mL)，分別加入100 μL高氯酸鹽內標溶液(200 ng/mL)，制成的高氯酸鹽濃度依次為：0.0 ng/mL、1.00 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、7.5 ng/mL、10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、75.0 ng/mL、100.0 ng/mL，標準工作液中高氯酸鹽-18O4濃度為2.0 ng/mL。

1.4.5上機測定：在相同試驗條件下，分別測定標準溶液和試樣，以標準溶液的濃度為橫坐標，以內標校正后的響應值為縱坐標繪制標準曲線。按下式(1)計算出試樣中高氯酸鹽的含量。以試樣的兩次測定平均值給出結果。

1.5 結果計算

試樣中高氯酸鹽的含量，按式(1)計算：

(1)

式中：X表示試樣中高氯酸鹽含量，μg/kg；c表示從標準曲線中讀出的試液中高氯酸鹽含量，ng/mL；V表示試樣溶液最終定容體積，單位為毫升(mL)；f表示試樣的稀釋倍數；m表示稱樣質量，g。

計算結果保留三位有效數字。

2 結果與討論

2.1 測定條件的優化

2.1.1流動相考察

標準流動相：A為乙腈，B為20 mmol/L甲酸銨溶液；改進后流動相：A為乙腈，B為20 mmol/L乙酸銨溶液，其他條件相同。上機后高氯酸鹽的出峰時間提前，提高分析效率,高氯酸鹽的響應值(從2 906.8變為6 594.2)幾乎提高了一倍，詳見圖1和圖2；氯酸鹽(RT: 1.030 min)與高氯酸鹽(RT: 2.624 min)的分離效果好，能消除測定過程中氯酸鹽的干擾，詳見圖3，故選用20 mmol/L乙酸銨溶液作為B流動相。

圖1 標準流動相甲酸銨的高氯酸鹽MRM圖

圖2 標準流動相乙酸銨的高氯酸鹽MRM圖

圖3 氯酸鹽和高氯酸鹽的TIC圖

2.1.2提取液的考察

準確稱取2 g乳粉，加入150 μL混合同位素內標液，分別加入5.0 mL 0.1%甲酸水溶液、5.0 mL 0.1%甲酸水溶液、5.0 mL 0.1%乙酸水溶液、5.0 mL 0.1%乙酸水溶液，混勻，水浴超聲，渦旋振蕩，再分別加入10.0 mL甲醇、10.0 mL乙腈、10.0 mL甲醇、10.0 mL乙腈，經混勻、凈化、上機測定，測得樣液中高氯酸鹽的濃度分別為1.79 ng/mL、1.71 ng/mL、2.48 ng/mL、1.85 ng/mL，說明在相同條件下，5.0 mL 0.1%乙酸水溶液和10.0 mL甲醇，提取效果最好，故選擇之。

2.1.3檢出限的考察

空白樣品(乳粉)中添加50 ng/mL標準高氯酸鹽溶液40 μL于2 g空白樣品(即加標濃度為1.0 μg/kg)，使用優化后的樣品處理方法和流動相，上機測定，測得高氯酸鹽的信噪比S/N為39.5、36.4、36.2、27.3、33.3和35.3均≥3，即檢出限可降低至1.0 μg/kg，該方法具有較高的靈敏度。

2.2 不確定度來源

根據CNAS-CL01: 2018《檢測和校準實驗室能力認可準則》要求，實驗室應分析和評定測量結果的不確定度。根據GB/T 27418—2017《測量不確定度評定和表示》[8]規范，合成標準不確定度由A類和B類組成。采用A類評定方法的有樣品重復性的測定；采用B類評定方法的有標準品的定值、標準曲線的擬合、移液槍、容量瓶、溫度波動、電子天平和LC-MS/MS儀器等。

2.2.1不確定度分量評定

2.2.1.1A類標準不確定度uA評定[9]

稱取乳粉樣品2.013 5 g和2.033 3 g兩份，經充分混合均勻、處理后上機測定，測得高氯酸鹽含量為23.53 μg/kg、23.68 μg/kg，其平均含量為23.6 μg/kg。

采用貝塞爾公式，單次測量的標準差為：

故高氯酸鹽含量測定重復性帶入的標準不確定度uA為：

2.2.1.2B類標準不確定度uB評定

(1) 體積的標準不確定度評定uB(V)

uB-3(V)=1.15%

(2) 標準品定值的標準不確定度uB(B)評定

(3) 擬合標準曲線的標準不確定度uB(Q)評定

① 配制六點質量濃度分別為1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL與100 ng/mL的高氯酸鹽標準使用液，每個質量濃度平行測量2次，用最小二乘法擬合標準溶液濃度-內標校正后的響應值曲線，標準溶液的測定結果見表1。

表1 高氯酸鹽標準溶液測定結果

得出，標準曲線回歸方程為：

y=0.334x+0.097 6，r=0.999 95

乳粉樣品加標6次后，經測定由標準曲線得到測試液中高氯酸鹽的質量濃度分別為0.979 ng/mL、0.938 ng/mL、0.947 ng/mL、0.956 ng/mL、0.966 ng/mL、0.963 ng/mL，其平均質量濃度c為 0.958 ng/mL 。

由擬合標準曲線求c時產生的標準不確定度按下式計算。

式中：SR為從標準曲線求得的內標校正后的響應值Y與相應測得的內標校正后的響應值Yi之差所求出的標準偏差；m為樣品溶液的測定總次數，此處m為6；n為標準溶液的測定總次數，此處n為12；c為樣品中高氯酸鹽質量濃度的平均值；c0為標準溶液中高氯酸鹽質量濃度的平均值；ci為標準溶液中高氯酸鹽的質量濃度。將數據代入計算公式得出：

② 配制九點高氯酸鹽標準濃度，增加7.5 ng/mL、25.0 ng/mL、75.0 ng/mL三個濃度點，經上機測定結果見表2。

表2 三點高氯酸鹽標準溶液測定結果

結合1中的六個點的結果得出，標準曲線回歸方程為：

y=0.333 8x+0.131 7，r=0.999 95

同樣，乳粉樣品加標6次經測定后，其平均質量濃度(c)為 0.958 ng/mL。此處m為6；n為18，將數據代入計算公式得出：

由此可見，增加標準溶液濃度點，會降低擬合標準曲線求C時帶入的標準不確定度。

(4) 設備的標準不確定度uB(s)評定

② LC-MS/MS帶入的標準不確定度uB-2(s)：由LC-MS/MS檢定證書可知，取k=2 時，LC-MS/MS的相對擴展不確定度為4%，由此帶入的標準不確定度uB-2(s)為：

2.2.2標準不確定度分量匯總

本實驗中不確定的來源有A類和B類分量，其數值分布大小，詳見表3。

表3 各不確定度分量分布

因此，擬合標準曲線過程中的不確定度是主要影響因素，通過增加標準溶液濃度點可最有效地降低本實驗的不確定度。

2.3 加標回收試驗

稱取乳粉樣本，進行3.0 μg/kg、15 μg/kg、75 μg/kg三個水平的加標回收實驗(n=6)，其回收率在90.0%～108.0%之間，RSD范圍為1.50%～2.39%，結果詳見表4。

表4 乳粉中高氯酸鹽加標回收試驗結果

2.4 其他樣品中高氯酸鹽的測定結果

通過本方法檢測，乳粉中高氯酸鹽的含量為23.6 μg/kg。同時，檢測了其他類型的食品，結果發現，大多數樣品中均有高氯酸鹽的檢出，其檢出的具體數據詳見下表5。雖然我國目前還未制訂食品中高氯酸鹽的限量標準，但根據歐盟委員會在2020年5月20日發布(EC)2020/685號條例，補充規定了五類食品的高氯酸鹽限量，部分產品超出了其限值，因此，食品中的高氯酸污染問題應引起有關部門的關注。

表5 其他樣品中高氯酸鹽的檢出數據

3 結論

本文采用LC-MS/MS法測定乳粉中的高氯酸鹽含量，經過優化方法，檢測結果為23.6 μg/kg，檢出限可達到1.0 μg/kg。對稱樣、樣品處理、配制標準溶液、上機測定等各個步驟帶入的不確定度分量進行了評定，其中，擬合標準曲線過程中帶入的不確定度是最主要的影響因素，當標準溶液濃度為6點時，標準不確定度uB(Q)=0.118；標準溶液濃度為9點時，uB(Q)=0.103。因此，建議在日常檢測過程中加強檢測人員的技能培訓，規范他們的基本操作，通過增加標準溶液濃度點降低標準不確定度，從而提高最終檢測結果的準確性。