瞬時納米沉淀法制備pH變色微膠囊及其性能

唐月婷，孟 凱，2，張克勤，2，趙薈菁，2

［1.蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇蘇州 215123；2.現代絲綢國家工程實驗室（蘇州），江蘇蘇州 215123］

花青素（anthocyanins）是一種天然水溶性色素，存在于許多植物的果實和有色花瓣中，屬于黃酮類多酚化合物，同時也是植物花瓣上主要的呈色物質。除了具有抗氧化、抗衰老等活性外［1］，花青素還可以在不同pH 的溶液中呈現不同的顏色［2］，在酸性條件下，水溶液呈紅色，溶液的主要成分為黃烊鹽離子；隨著pH 的增加，在中性條件下，花色苷在溶液中以無色的甲醇假堿存在；在堿性條件下，花色苷主要表現為藍色的醌式堿，溶液顏色變深。相比其他酸堿指示劑，花青素具有天然無毒、變色范圍廣的優點，特別適合用于與人體相接觸的變色材料。王芳［3］和Roy等［4］將花青素與食品包裝材料結合制備智能指示膜，利用花青素的顏色變化指示食品新鮮度，但其顯色和穩定性需要進一步提高，特別是熱穩定性。

因為花青素活性很高，在加工、使用過程中，許多外界因素（如光、熱、氧氣等）都會影響花青素的穩定性，從而限制了它的應用范圍［5-8］。為提高花青素的穩定性，有些學者用合適的材料包埋花青素制成微膠囊［9-12］，將花青素與外界環境隔離，能更有效地提高花青素的穩定性。如陳程莉［9］以黑枸杞花青素為芯材，以糯米淀粉、改性糯米淀粉等5 種材料為壁材，采用噴霧干燥法制得微膠囊，考察了壁材對微膠囊穩定性和緩釋性能的影響，并將其應用于食品工業；單冠程等［12］用海藻酸鈉作壁材、黑米花青素為芯材，經離子凝膠化，采用微膠囊包埋機通過雙噴頭包埋法制備黑米花青素微膠囊，并將其應用于食品科技領域；李星宇［2］用海藻酸鈉、殼聚糖包埋花青素制備微膠囊，可以提高花青素的穩定性，從而延長易氧化食品的保質期。

微膠囊技術是提高生物活性化合物在溫度、光和氧氣等環境中穩定性的有效手段。微膠囊具有核殼結構，通常包括壁材和芯材兩部分［13-14］。微膠囊技術能隔離芯材與外部環境，有效地降低與外界環境因素的反應，使芯材在穩定的環境中存在，避免外界環境變化引起芯材損耗和反應等諸多問題［15］。瞬時納米沉淀（FNP）法［16-17］是一種根據動力學控制原理，利用化學工程中的流體湍流混合制備微/納米材料的新型技術，可在極短的時間內制備含有機活性物質的聚合物納米粒子。FNP 法的技術特點是通過溶劑與非溶劑的快速混合，使溶解狀態的聚合物溶解度下降，從溶液中析出，并將芯材包覆形成微膠囊［18］。這種方法不僅具有粒徑易于調控、尺寸分布窄、制備時間短（毫秒級）、易于放大與連續化等特點，還可以系統地調控納米微觀結構，如形貌、內部結構、表面結構等，為微/納米材料在紡織材料上的高效、低毒利用提供幫助［19］。

聚己內酯（PCL）是一種生物可降解聚合物，對小分子有較高的滲透性，具有良好的生物相容性和無毒性，特別適用于制藥領域納米顆粒的生產和生物應用［20］。因此，本研究以PCL 為壁材，將其溶于四氫呋喃（THF）中，以紫甘藍花青素（RCA）為芯材，將其溶于水中，采用FNP 法在密閉撞擊射流混合器（confined impingingjet mixers，CIJM）中制備微膠囊，將RCA 包埋在聚合物基質中，減少與外界環境的接觸，以提高RCA 作為pH 變色指示劑的穩定性。

1 實驗

1.1 材料和儀器

試劑：聚己內酯［PCL，Mn=60 000～65 000 Da，阿拉丁試劑（上海）有限公司］，四氫呋喃（THF，純度大于等于99.5%，江蘇強盛功能化學股份有限公司），紫甘藍花青素（RCA，純度大于等于25%，西安雅圖生物科技有限公司），鹽酸、磷酸二氫鉀、氯化鉀（色譜純，國藥集團化學試劑蘇州有限公司），鄰苯二甲酸氫鉀（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司），氫氧化鈉（分析純，天津市大茂化學試劑廠），硼酸（99.8%，商丘市亮峰衛生用品有限公司），去離子水。

儀器：LSP01-1B 型LSP 實驗室注射泵（保定迪創電子科技有限公司），HJ-4A 型多頭磁力攪拌器（江蘇科析儀器有限公司），AR224CN 型電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］，密閉撞擊射流混合器（自制），PS-20A 型超聲波清洗器（深圳市臻潔康科技實業有限公司），H3-18KR 型臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司），LGJ-10 型真空冷凍干燥機（寧波新藝超聲設備有限公司），PH818 型筆式pH檢測計（希瑪科技有限公司），S-4800 型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司），Nicolet 5700 iS5型傅里葉變換紅外光譜儀（美國熱電公司），Nano ZS90 型納米粒徑/電位分析儀（馬爾文儀器有限公司），Specord S600型紫外-可見分光光度計（德國耶拿分析儀器股份公司），SDT2960 型熱重/差熱聯用儀、DSC250 差示掃描量熱儀（美國TA 公司）。

1.2 制備方法

RCA溶液的配制：分別稱取0.25、0.50、0.75 g RCA加入到50 mL 去離子水中，攪拌至完全溶解，制得質量濃度分別為5、10、15 mg/mL 的RCA 溶液。

PCL 溶液的配制：分別稱取0.25、0.50、0.75 g PCL加入到50 mL THF 中，攪拌至完全溶解，制得質量濃度分別為5、10、15 mg/mL 的PCL 溶液。

FNP 法制備微膠囊的過程如圖1 所示。使用兩臺注射泵分別將RCA 溶液和PCL 溶液以相同的流速注入CIJM 的兩個入口（內徑=1 mm），在注射泵的推動作用下，兩股流體以一定的流速在混合器中發生碰撞混合，溶有PCL 的有機溶劑在毫秒級的時間內和水在CIJM 中快速混合，在極短的時間內產生足夠高的過飽和度，產生固液相分離，使PCL 形成疏水的納米核心，新形成的成核種子捕獲溶解的分子（RCA）并生長形成微膠囊［21］。碰撞混合后的溶液從混合器的出口（內徑=2 mm）流到裝有去離子水的燒杯中，形成微膠囊懸浮液，輕輕攪拌2 min以避免顆粒聚集。

將微膠囊懸浮液用孔徑為0.1 μm 的濾膜過濾，并加去離子水清洗，重復3 次，然后在-50 ℃下冷凍過夜，在溫度低于-50 ℃和真空度低于20 Pa 的條件下冷凍干燥48 h（確保完全去除水分），得到微膠囊粉末。制備樣品及工藝參數如表1所示。

表1 樣品及工藝參數

1.3 測試

1.3.1 微觀形貌與結構

微觀形貌：采用掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）觀察PCL/RCA 微膠囊的形貌。

掃描電鏡：將微膠囊溶液過濾清洗后超聲處理5 min，滴在載玻片上，在室溫下干燥，噴金90 s 后，在5 kV 能量下采用掃描電子顯微鏡觀察微膠囊的微觀結構形貌。

透射電鏡：將微膠囊溶液過濾清洗后超聲處理5 min，轉移到300 目碳支持膜銅網上，紅外干燥后，在120 kV 能量下對微膠囊進行透射電鏡觀察。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

為分析微膠囊中的成分，用傅里葉變換紅外光譜儀對純RCA、純PCL 和PCL/RCA 微膠囊粉末分別進行測試。以溴化鉀壓片法制備試樣，掃描范圍為400～3 500 cm-1，分辨率為0.5 cm-1。

1.3.3 包封率及加載率

標準曲線繪制：配制不同質量濃度的RCA 溶液進行紫外全譜掃描，已知花青素的兩個最大吸收波長，一個位于465～550 nm 的可見光范圍內，另一個位于270～280 nm 的紫外光范圍內［22］，設置掃描波長在400～600 nm，找到其可見光范圍內的最大吸收波長，并在最大吸收波長下測定不同質量濃度RCA 溶液的吸光度，繪制吸光度對質量濃度的標準曲線，計算線性相關系數。

測量微膠囊懸浮液超速離心后上清液中的游離RCA質量濃度，間接估算微膠囊的包封率（encapsulation efficiency，EE）。通常認為包封率越高越好，包封率越高證明壁材能更多更好地包埋住花青素，阻隔了外界環境因素對花青素的影響［9］。將微膠囊溶液在室溫下離心，以9 000 r/min 離心1 h，用紫外-可見分光光度計在最大吸收波長處測定上清液中RCA 的質量濃度，計算出包封率。

微膠囊的包封率與加載率（loading capacity，LC）計算公式如下所示：

1.3.4 粒徑及其分布

微膠囊粒徑一般難以用肉眼觀察。用馬爾文粒度儀測定PCL/RCA 微膠囊原液的平均粒徑及粒徑分布，重復測量3次取平均值。

1.3.5 pH 變色響應性實驗

1.3.5.1 配制pH 緩沖溶液

根據GB/T 4015—2008《化學試劑 酸堿指示劑pH 變色域測定通用方法》配制得到pH 為3～10 的緩沖溶液，然后觀察PCL/RCA 微膠囊在緩沖溶液中的pH 變色響應性。pH 為3～10 緩沖溶液的具體配制方法見表2。

表2 pH 為3～10緩沖溶液的配制方法

1.3.5.2 顏色量化方法

HSV（hue，saturation，value）顏色空間基于顏色的直觀特性，H表示色相，S表示飽和度，V表示明度［23］。色相環如圖2 所示，色相H值中，0°或360°為紅色，60°為黃色，120°為綠色，180°為青色，240°為藍色，300°為品紅色。HSV 對于用戶來說是一種很直觀的顏色模型，在計算機視覺、遙感圖像處理識別等領域相對RGB 顏色模型具有獨特優勢［24］。但人眼的色彩感知和RGB 顏色空間之間有很大差別，與HSV 顏色空間比較接近，HSV 模式在視覺上能更好地體現色彩與亮度的差異。該方法在圖像處理中具有獨特優勢：（1）亮度與色度是區分開來的，亮度分量和圖像色彩信息不相關；（2）色調和飽和度相互獨立，并且與人類感知密切相關［25］。根據人眼視覺特性，在圖像分析中優先選擇HSV 顏色空間進行色彩分析。

通過ON COLOR 顏色探測器對圖像的顏色信息進行數字化處理，對圖像進行顏色信息量化。拍照環境為室內自然光源，拍攝鏡頭垂直于地面，使用智能手機（分辨率16 MP）采集圖像，每組溶液連續拍攝3張相片，計算3張相片的H分量平均值。

與傳統的目視比色法相比，數字圖像比色法不僅可以利用圖像分析方法識別和提取pH 指示材料的色彩信息，還能識別出小的顏色變化，避免了視覺觀測方法主觀性因素的影響，實現了色彩信息量化，提高了檢測準確度，實現了快速檢測且可對顏色變化進行定量分析，大大提高了顏色變化識別的準確性。

1.3.6 統計學方法

每組數據均重復3 次并計算平均值，使用Origin對數據進行繪圖處理，運用SPSS 17.0 對數據進行正交實驗分析和ANOVA 差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 微觀形貌與結構

以5 mg/mL PCL 溶液和10 mg/mL RCA 溶液制得的微膠囊為例，微膠囊表觀形貌如圖3 所示。由圖3a、3b 可知，PCL/RCA 微膠囊是較規整的球形結構，表面無孔洞和裂紋，部分微膠囊的表面有不規則的凹陷和褶皺，這是干燥過程中微膠囊表面水分蒸發造成的，或在噴金過程中高真空所導致。

為了分析花青素在微膠囊中的分布情況，通過透射電鏡對微膠囊進行了觀察，結果如圖3c 所示。由圖3c 可以看出，透射電鏡顯示得到的微膠囊內部有大塊黑色被包裹物質；通過電子穿透樣品成像，紅色箭頭指向處可明顯看到其外層包覆有一層壁材。這證明PCL 與RCA 形成了微膠囊核殼結構。

2.2 FTIR

傅里葉變換紅外光譜圖中同時出現囊芯和囊壁的特征吸收峰，可以用來確定芯材和壁材的存在［26］。用紅外光譜儀對純PCL、純RCA 和包裹花青素的微膠囊粉末進行掃描測試，結果如圖4所示。

由圖4a、4b 可以看出，在1 730 cm-1處的羰基（C—O）伸縮振動、2 950 和2 870 cm-1處飽和碳（—CH2—）上的C—H 伸縮振動、1 470～1 350 cm-1處的C—H面內彎曲振動、1 250～1 140 cm-1處的C—O—C 伸縮振動、3 340 cm-1處的O—H 伸縮振動、800 cm-1處的O—H 彎曲振動吸收峰非常吻合。PCL/RCA 微膠囊的紅外光譜圖與純PCL 的圖譜一致，說明微膠囊中存在聚己內酯，證實了外殼材料是聚己內酯。

花青素主要由苯環、含氧雜環、羥基等部分組成［27］。由圖4a、4c 可以看出，在3 280 cm-1處的酚羥基O—H 振動、2 930 cm-1處的C—H 伸縮振動、1 650 cm-1處的苯環（C— C）伸縮振動、1 025 cm-1處的C—H面內彎曲振動非常吻合，說明微膠囊中存在花青素。PCL 包埋RCA 后，沒有出現明顯的譜峰位移，說明兩種物質沒有發生基團反應。結合電鏡分析可確定，芯材RCA 被成功包覆在PCL 殼中。

2.3 包封率及加載率

2.3.1 標準曲線繪制

由圖5 可以看出，紫甘藍花青素最大吸收波長為535 nm。

根據不同質量濃度紫甘藍花青素水溶液的紫外吸光度數據進行繪圖和線性擬合，結果如圖6所示。應用數學擬合方法，得到花青素的標準曲線關系式為：

式中，x為RCA 的質量濃度（mg/mL），y為RCA 的吸光度。在所選質量濃度范圍內，RCA 質量濃度與紫外吸光度線性關系良好。

2.3.2 包封率及加載率測試結果

由表3 可以看出，微膠囊的包封率和加載率受注射泵進料流速和進料質量濃度的影響，注射泵進料流速和RCA 質量濃度越大，包封率和加載率越大；聚己內酯質量濃度越大，加載率越小，對包封率無明顯影響。

表3 微膠囊包封率及加載率測試結果

2.4 粒徑及其分布的影響因素

2.4.1 進料流速

圖7 顯示了微膠囊平均粒徑隨注射泵進料流速的變化趨勢。

由圖7 可看出，隨著進料流速從20 mL/min 增大到60 mL/min，微膠囊平均粒徑逐漸減小，粒徑分布更加集中。這可以用沉淀特征時間尺度來解釋：當進料流速增加時，特征混合時間減少，成核優于生長，粒子越來越小。在較高的注射泵進料流速下，聚己內酯的過飽和度較大，會形成更多的疏水核心，導致得到的微膠囊粒徑更小；并且在更高的流速下，液體混合得更加均勻，較高流速下混合液體在混合腔中停留的時間較短，微膠囊的生長時間也相應減小［28］。

2.4.2 花青素質量濃度

圖8 給出了不同質量濃度花青素溶液制備的微膠囊平均粒徑及其分布圖。由圖8 可以看出，微膠囊的粒徑都呈單峰正態分布，隨著花青素質量濃度的降低，微膠囊平均粒徑逐漸減小，且粒徑分布更集中。這是RCA 有效摻入聚合物體系的結果。在微膠囊生產過程中，始終可以獲得較高的包封率，使得活性物質的損耗少。初始RCA 質量濃度較低的樣本，包封率最低。原因是隨著花青素質量濃度的降低，RCA 能被聚合物有效包裹的量減少，從而粒徑更小。

2.4.3 聚己內酯質量濃度

圖9 給出了不同質量濃度PCL 溶液制備的微膠囊平均粒徑及其分布圖。由圖9 可以看出，隨著PCL質量濃度的增大，微膠囊的平均粒徑增大，粒徑分布范圍變大，而包封率無明顯變化。原因可能是隨著PCL 質量濃度的增大，微膠囊在生長階段能獲得更多的聚合物，粒徑更大，最終得到微米大小的顆粒。

2.5 pH 變色響應性

2.5.1 純花青素顯色

取少量RCA 粉末，滴加pH 為3～10 的緩沖溶液，RCA在不同pH下的顏色如表4所示，并用ON COLOR軟件識別H值。

表4 紫甘藍花青素顏色與H 值隨pH 的變化

由表4 可以看出，隨著酸堿度從酸性變為堿性，RCA 顏色變化顯著，pH 為3～4 時，RCA 顯紅色；pH 為5～6 時為紫紅色；pH 為7 時顯示紫色；pH 為8～9 時顯示藍色；pH 為10 時呈現綠色。采集得到的原始影像數據經預處理后得到每組相片的H值，結果見表4。

2.5.2 微膠囊顯色

取少量微膠囊粉末（樣品5）置于濾紙上，分別滴加pH 為3～10 的緩沖溶液，PCL/RCA 微膠囊在不同pH 下的顏色如圖10 所示。由圖10 可以看出，PCL/RCA 微膠囊在不同pH 下具有明顯不同的顏色，隨著pH 的增加，微膠囊相應產生3 個不同的顏色。其中，當pH 小于5 時，微膠囊呈紅色；當pH 為5～9 時，微膠囊由紅色向紫色轉變；當pH 大于9 時，微膠囊顏色轉變為藍色，顯色結果與花青素趨勢一致。

由表5 可以看出，在pH 為3～10 時，微膠囊色相H值隨著緩沖溶液pH 的增加，從340°（紅色）左右逐漸降低到225°（藍色）左右，顏色由紅色逐漸變為藍色。根據H值數值的變化可以判斷，雖然微膠囊顯色后H值與花青素不完全一致，但數值接近且變色趨勢相同，H值都隨pH 的增大而減小，顏色由紅色向藍色轉變，可以作為酸堿指示微膠囊應用。

表5 pH 變色微膠囊在pH 為3～10時的H 值分量

3 結論

采用瞬時納米沉淀法制備了一種聚己內酯（PCL）/花青素（RCA）微膠囊。所制備的微膠囊形態為球形，表面光滑完整，沒有裂縫和孔隙，能對芯材RCA 起到有效的包埋。微膠囊粒徑大小與RCA、PCL質量濃度成正相關，與注射泵進料流速成負相關。微膠囊的包封率與注射泵進料流速和RCA 質量濃度成正相關，PCL 質量濃度對花青素包封率影響較小。微膠囊樣品在pH 為3～10 時可從紅到紫到藍連續變色，顯示其在傷口酸堿度監測醫用敷料領域的潛在應用價值。