植物無糖培養微繁殖技術在蘋果工廠化育苗中的應用

楊成賀 姜世豪 肖玉蘭

（1上海離草科技有限公司，上海 200240；2浙江清華長三角研究院，嘉興 314006）

實踐表明，采用蘋果脫毒種苗進行栽培生產，能有效增強蘋果樹的樹勢，提高蘋果樹的抗逆性，進而提高蘋果的產量和品質，故目前蘋果脫毒種苗的市場需求量巨大。但是，目前的蘋果脫毒種苗主要是依靠傳統的植物有糖組培技術來獲得的，且在蘋果脫毒種苗的有糖組培工廠化生產過程中，存在著植株生根慢、長勢弱、緩苗期長、成苗率不高等問題，這些均制約了蘋果脫毒種苗的規模化和產業化生產。而大量研究表明[1-2]，相比傳統的植物有糖組培技術，應用植物無糖培養微繁殖技術（該技術又稱光自養微繁殖技術，是指容器中的小植株在人工光照條件下，通過吸收CO2進行光合作用，以完全自養的方式進行生長繁殖）進行組培苗的繁育，能有效促進組培苗的生長和發育，大幅度降低組培污染率，明顯縮短整個生產周期。因此，有望在蘋果工廠化育苗中進行植物無糖培養微繁殖技術應用。在此背景下，筆者進行了植物無糖培養微繁殖技術在蘋果工廠化育苗過程中的生根培養階段的應用試驗，并在陜西青美生物科技有限公司進行了該技術的實際應用，以期促進該技術在蘋果工廠化育苗中的應用，及為該技術在其他作物上的應用提供參考借鑒。現將相關試驗結果和該技術的實際應用情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以蘋果矮化砧木品種M9T337增殖培養30 d的試管苗為材料，選取平均高度為3.04 cm、葉片數為9.6張、鮮重為108.4 mg、干重為13.5 mg的單株試管苗作為生根培養的接種材料。

1.2 試驗設計

試驗設2個處理：（1）無糖培養微繁殖。該處理采用上海離草科技有限公司開發生產的植物無糖培養系統（該系統由培養容器、空氣過濾裝置、自然換氣裝置和強制換氣裝置組成，相關設備安裝于培養室組培架上，培養室獨立配備CO2供給系統和補光燈）。接種容器是尺寸為28 cm（長)×22 cm（寬）×15 cm（高)的長方形底無糖培養盒，每盒加入含水量為35%（重量比）的無菌蛭石350 g、無糖液體培養基（培養基為1/2 MS培養基，不加糖、瓊脂、激素和有機物，pH為5.8）800 mL，每盒接種蘋果試管苗150株，合計接種6盒，作為3次重復（每重復2盒）。培養時間為30 d，培養溫度為25±2℃，光照強度為100±18 μmol/（m2·s），光照時數為14 h/d，CO2濃度為 800～1 000 μmol/mol，培養室通氣時間與光照時間相同。（2)有糖培養微繁殖。該處理的培養基為1/2 MS+IAA 0.3 mg/L+瓊脂4.2 g/L+蔗糖30 g/L、pH 5.8，接種瓶為7 cm(直徑)×9 cm(高)的圓形底組培瓶，每瓶接種蘋果試管苗8株，合計接種114瓶，作為3次重復（每重復38瓶）。培養時間為40 d，培養光照強度為50±18μmol/(m2·s），其他培養條件與無糖培養微繁殖處理相同。

1.3 調查項目及方法

分別在無糖培養30 d和有糖培養40 d后，每處理隨機抽取30株生根苗，測定生根苗的株高、單株葉片數、單株鮮重、單株干重和單株根數，隨后兩個處理的所有生根苗均轉移到溫室進行煉苗和移栽，分別統計成活率。

2 結果與分析

2.1 不同培養方式的蘋果試管苗生長情況

由表1可知，無糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗的平均株高為7.68 cm、單株葉片數為14.8張、單株鮮重為720.1 mg、單株干重為81.4 mg，有糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗的平均株高為3.59 cm、單株葉片數為10.4張、單株鮮重為220.6 mg、單株干重為26.3 mg，無糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗的株高、單株葉片數、單株鮮重、單株干重分別是有糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗的2.1倍、1.4倍、3.3倍、3.1倍，表明無糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗的長勢明顯優于有糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗。同時，無糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗的生根率為94.67%、平均單株根數為8.2條，且根部無愈傷組織，根系呈白色、粗壯，不同植株間根系的生長發育差異較小；而有糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗的生根率為90.02%、平均單株根數為6.4條，根部有較為明顯的愈傷組織，根系呈淡黃色，不同植株間根系的發育差異較大。

表1 不同培養方式的蘋果試管苗生長情況

2.2 不同培養方式的蘋果試管苗煉苗和移栽情況

由表2可知，無糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗在生根培養30 d后，即可轉移到溫室進行煉苗（即將培養容器開蓋置于溫室中，使蘋果生根苗適應外界環境），煉苗5 d后即可進行移栽（即將蘋果生根苗帶蛭石直接從培養容器中栽種至育苗杯中，并澆透水），遮陽緩苗處理3 d后即可除去遮陽設施進行蘋果種苗的正常管理，從蘋果試管苗生根培養到溫室種苗的正常管理，無糖培養微繁殖處理合計需要38 d，且種苗移栽成活率高，達83.22%。有糖培養微繁殖處理的蘋果試管苗在生根培養40 d后，才能轉移到溫室進行煉苗（即將組培瓶置于溫室中，先不開蓋過渡適應7 d，再開蓋緩苗處理7 d），煉苗14 d后進行移栽（為保證移栽成活率，需先進行生根苗根系上的瓊脂清洗處理工作，然后將生根苗栽種在育苗杯中，并澆透水），遮陽緩苗處理7 d后才可進行蘋果種苗的正常管理，從蘋果試管苗生根培養到溫室種苗的正常管理，有糖培養微繁殖處理需61 d，且種苗移栽成活率僅為58.83%，明顯低于無糖培養處理（表2）。

表2 不同培養方式的蘋果試管苗煉苗和移栽情況

3 植物無糖培養微繁殖技術在蘋果工廠化育苗中的應用實例

目前，上海離草科技有限公司開發了可以直接用于蘋果脫毒種苗工廠化生產的植物無糖培養系統，該系統經陜西青美生物科技有限公司應用（該公司當前已投入使用的無糖培養室面積為300 m2），每月可生產蘋果無糖組培苗約52萬株，相比于傳統的有糖組培技術，種苗數量提高了1.4倍，種苗繁育周期縮短了一半，種苗移栽成活率得到了保證，培養室單位面積利用率也有了一定程度的提高。見表3。

表3 無糖培養微繁殖技術與有糖培養微繁殖技術的應用對比

4 結論與討論

4.1 關于植物無糖培養微繁殖技術在蘋果工廠化育苗中的應用優勢

4.1.1 植株長勢好

在傳統的植物有糖組培中，植物主要以糖為碳源，以異養的方式來獲取其植株生長所需的養分，而在植物組培過程中，培養基中的糖是造成污染的主要原因之一，故為了減少污染，在組培過程中，不得不使用封閉的、小的培養容器，以減少容器與外界的氣體交換，這就導致培養容器內的環境條件不便于調控，植物生長在透氣性差且高溫高濕的環境中，造成了其植株長勢差、生長發育不良甚至死亡。而采用植物無糖培養微繁殖技術，植物的碳源來自于空氣中的CO2，培養基中不添加糖，可使用大空間的培養容器，這不僅大大減少了污染的發生，還便于培養容器內部環境條件的調控[3]，使植物生長在適宜的溫度和濕度下，且通過提高培養容器內部的光照強度和CO2濃度，可以極大地促進其植株的光合作用，使植株的干物質積累和生長發育速度加快，故最終培養出的種苗在植株長勢方面表現較好，明顯優于有糖培養苗[4]。例如，肖玉蘭等[5]比較了非洲菊的無糖培養苗和有糖培養苗，無糖培養苗的植株在長勢和干物質積累方面明顯優于有糖培養苗；和世平[6]在進行半夏無糖培養研究時發現，半夏無糖組培苗的株高顯著高于有糖組培苗。在本試驗中，采用無糖培養微繁殖技術培養出的蘋果種苗的植株長勢也顯著優于采用有糖培養微繁殖技術培養出的蘋果種苗，進一步證實了植物無糖培養微繁殖技術在木本植物組織培養上應用具有一定的優勢。

4.1.2 生根質量高

傳統的植物有糖組培中常常使用凝膠狀的物質（如瓊脂、卡拉膠等）作為生根培養基質，這些培養基質的透氣性極差，且在進行滅菌后，其中的O2已完全散失，這不利于植株的根系生長發育，導致生長發育出的根系細弱，移栽時根系易受到損傷。而植物無糖培養可以采用多孔的無機物質（如蛭石、珍珠巖、沙等）作為生根培養基質，這些培養基質有較高的空氣擴散系數，透氣性較好，可大大改善植物的生根環境，有助于根系對養分的吸收，進而促使根系早生快發，且生長發育良好[7]。在本試驗中，采用無糖培養微繁殖技術的蘋果試管苗的生根率比采用有糖培養微繁殖技術提高4.65%，生根質量也明顯提高，這與本試驗采用多孔的蛭石作為生根培養基質有極大的關系。采用多孔的生根培養基質有利于提高植物組培苗的生根質量這一結論，在桉樹、甘薯、咖啡、山竹果等多種作物上均得到了驗證[1]。例如，祁永瓊[8]在仙客來的無糖組培中，使用蛭石和珍珠巖作為生根培養基質，與使用瓊脂作為生根培養基質的有糖培養相比，無糖培養苗的根系發育和生根率均優于有糖培養苗。

4.1.3 生產周期短

在本試驗中，無糖培養微繁殖處理的蘋果種苗生產時間比有糖培養微繁殖處理減少了23 d，且最終的種苗移栽成活率提高24.39%。究其原因：植物有糖培養容器內蘋果試管苗的生長環境與外界環境的差異較大，且高溫高濕的環境易造成蘋果試管苗的組織結構和氣孔功能異常，在蘋果生根苗向瓶外過渡時，蘋果生根苗需要進行營養方式的轉變（即異養→自養），并需要逐漸恢復正常的組織結構和氣孔功能來適應外界環境條件，這個過程需要繁瑣的煉苗程序和較長的時間。而無糖培養微繁殖處理可通過環境條件調控，使培養容器內蘋果試管苗的生長環境與外界環境高度相似，故蘋果生根苗對外界環境的適應能力較好，再加上蘋果生根苗植株能夠保持正常的組織結構和氣孔功能，能以完全光合自養的方式來獲取其生長所需的養分，且具有較高的光合能力，故蘋果生根苗在煉苗和移苗時，無需進行營養方式的轉變，這不僅大大縮短了煉苗時間，還保證了良好的移栽成活率。因此，在蘋果工廠化育苗中應用無糖培養微繁殖技術，能夠有效縮短蘋果種苗的生產周期，簡化移苗過渡程序。

4.2 關于植物無糖培養微繁殖技術的發展和應用

植物無糖培養微繁殖技術在蘋果工廠化育苗中的成功應用，為其他作物工廠化育苗提供了良好的參考借鑒，相信在未來的種苗工廠化生產中，植物無糖培養微繁殖技術將有著非常廣闊的應用前景。

值得注意的是，植物無糖培養微繁殖技術在應用時，對其培養容器內部的環境條件調控顯得極為關鍵，這也對培養容器提出了較高的要求。目前，關于植物無糖培養裝置的開發，國內外已進行了不少試驗和研究[9]，但以往研發出的無糖培養裝置多為大體積的箱式培養系統，該類系統對培養室的改造要求較大，且價格昂貴，再加上植物無糖培養微繁殖技術在前期的接種操作和后期的培養管理上，均較為不便，這就導致植物無糖培養微繁殖技術難以在種苗規模化和產業化生產上進行應用，相關裝置設備也難以在組培苗生產中進行大面積應用，這些問題均有待進一步研究解決。