中藥川芎的熱性物質基礎探索*

程薇薇，劉建利，史 敏，畢芳芳，張 露，何仕龍，高欣怡

(1.西安培華學院醫學院，陜西 西安 710125；2.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069)

寒熱藥性是中藥的基本屬性，是中醫臨床辨證用藥的基礎[1]。《黃帝內經》《神農本草經》《本草經集注》等歷代醫書對寒熱藥性都有記載，說明中藥寒熱藥性的重要地位[2]。中藥治療疾病的物質基礎是其所含的化學成分，故中藥發揮寒熱藥性的物質基礎也應該是所含的化學成分。其可能是具有相似化學結構和共同藥理作用的一類或多類化合物共同組成的物質群體[3]。中藥川芎來源于植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)的干燥根莖，具有活血行氣、祛風止痛的功效；性溫，味辛；化學成分主要為揮發油、生物堿、多糖等[4]。川芎嗪，即四甲基吡嗪，是從川芎干燥根莖中提取的吡嗪類生物堿，是川芎的主要有效成分[5]。本文選擇川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪)及其類似化學成分(2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪)對其寒熱屬性進行評價。這4種化合物具有相同的含氮雜環母體結構，只是取代基團甲基的位置和數量有所區別。本文通過考察該4種化合物的寒熱屬性，研究中藥川芎的熱性物質基礎，同時探索甲基吡嗪類化學成分結構與寒熱屬性之間的構-性關系。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞株

人乳腺癌細胞MCF-7的傳代細胞，西安交通大學醫學院提供。

1.2 實驗儀器

μQuant酶標儀(美國Bio-Tek)、CO2培養箱(sanyo公司)、細胞96孔培養板、普通倒置光學顯微鏡、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.3 藥品與試劑

2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪；HyClone改良型RPMI-1640培養液(賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司)；四季青無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；噻唑藍(MTT，西安舟鼎國生物技術有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，純度大于99.5%，西安舟鼎國生物技術有限公司)；PBS(磷酸緩沖液)；胰蛋白酶(西安舟鼎國生物技術有限公司)。

2 實驗方法

2.1 受試藥品溶液的制備

分別取 50 mg 的2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，溶于 50 mL DMSO中，使質量濃度為 10 mg/mL。

2.2 細胞培養

MCF-7細胞，于含有10%胎牛血清的1640培養液(pH 7.0～7.5)中，在恒溫培養箱中 37 ℃、5%CO2及飽和濕度傳代培養。

2.3 MTT實驗

取對數生長期的MCF-7細胞，調整細胞密度為5×107/L，接種于96孔板，每孔 200 μL，置于恒溫培養箱中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養 24 h。細胞貼壁后，換新鮮培養液(200 μL)。實驗組加入不同體積的藥品溶液(10 mg/mL)，使終濃度分別為0.25、0.125、0.025、0.01(μmol/mL)。同時，設置空白對照組和調零孔，每個處理組設置3個平行孔。96孔板置于恒溫培養箱中培養 48 h 后，換新鮮培養液，逐孔加入新鮮配置的MTT溶液(5 g/L)20 μL 繼續培養 4 h。吸棄上清液，每孔加入 150 μL DMSO，震蕩 10 min(60次/min)后，用酶聯免疫標定儀測定 490 nm 處光吸收值(A值)。按公式(1)計算細胞抑制率。

(1)

抑制率為正值表示對細胞生長增殖有抑制作用，負值表示對細胞有促增殖作用[16]。實驗重復3次。

2.4 數據分析

3 結果

MTT法測得4種甲基吡嗪類化合物的4個濃度梯度處理組及對照組的吸光度值及細胞抑制率結果見表1。

表1 4種甲基吡嗪類化合物對MCF-7細胞體外增殖的影響

由表1可知，4種甲基吡嗪類化合物在一定濃度范圍內對MCF-7生長增殖均具有促進作用。其中，2,3-二甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪在所選濃度全程范圍內均表現為促進作用；2,3,5-三甲基吡嗪在0.01～0.125 μmol/mL 范圍內為促進作用，2,5-二甲基吡嗪在最低濃度時為促進作用。

4 討論

筆者課題組已建立并驗證的判斷方法為:如果在所選濃度范圍內藥物對細胞生長增殖有促進作用或低濃度促進、高濃度抑制,則判定為熱性。如果在所選濃度范圍內表現為抑制，有可能是寒性，也有可能為熱性的高濃度表現；此時可將濃度范圍繼續向低濃度方向延伸，如果還表現為抑制則為寒性，如果表現為促進則確定為熱性[6]。據此可判定，4種甲基吡嗪類化合物的寒熱屬性均為熱性。

本研究表明，首先，川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪)作為中藥川芎的重要標志性化學成分，是川芎發揮溫熱藥性的物質基礎之一。其次，4種甲基吡嗪化合物具有相同的含氮雜環母體結構，只是取代基團甲基的位置和數量有所區別，而它們的寒熱屬性都表現為熱性。因此，化合物的寒熱屬性與其結構之間存在特定的聯系，即母體結構、取代基團均類似的同一類化合物其寒熱屬性相同；但對于母體結構類似而取代基團不同的化合物，其寒熱屬性與取代基團之間的聯系還需進一步研究。最后，本文研究的4種甲基吡嗪類化合物的寒熱屬性均為熱性，提示中藥所含的同一類化學成分寒熱屬性是一致的，但中藥是由多種化學成分共同組成的復雜體系，其寒熱屬性應該是多種化學成分寒熱效應的綜合體現。總之，本文的研究結果可為中藥寒熱藥性的物質基礎探尋及其與所含化學成分之間的構-性關系研究提供參考。