肥胖兒童血清microRNA-27a、PPAR-γ與胰島素抵抗的相關性研究*

寇永妹，陳新春，谷小娜，楊振朋，孫國華

（唐山市人民醫院兒內科，河北唐山 063001）

肥胖是指機體脂肪局部含量和/或總含量增多或分布異常的狀態。近年來隨著生活水平的提高和生活方式的改變，我國兒童肥胖患病率迅速上升，數據顯示，1985年—2014年我國≥7 歲兒童肥胖率從0.5%上升至7.3%，預計2020年兒童肥胖率將達到22.3%[1-2]。肥胖不僅嚴重影響兒童生長發育，還是一種獨立的慢性代謝性疾病，與胰島素抵抗（insulin resistance,IR）密切相關，是2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝、代謝綜合征等慢性疾病的重要危險因素，并會增加成年期慢性疾病的風險[3-4]。IR 發病機制復雜，microRNA（miRNA）是一類非編碼RNA 分子，能降解靶基因和/或抑制靶基因翻譯，在IR 中發揮重要作用[5]。microRNA-27a（miR-27a）是一種與肥胖相關的miRNA，既往研究報道miR-27a 在肥胖患者血清中表達上調，其過表達可導致骨骼肌對葡萄糖消耗和攝取能力的降低[6-7]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）是胰島素敏感性的重要調控因子，能入核調控具備PPAR 特異性反應元件的下游基因，維持血糖穩態，該基因缺失將導致IR[8]。研究[9]顯示，PPAR-γ 為miR-27a參與代謝的關鍵靶基因。目前關于miR-27a 和PPAR-γ 與肥胖兒童IR 的關系鮮有報道，本研究旨在分析肥胖兒童血清miR-27a、PPAR-γ 與IR 的相關性，以期為改善肥胖兒童IR 提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2021年7月唐山市人民醫院104 例肥胖兒童為肥胖組。其中，男性64 例，女性40 例；年齡7～14 歲，平均（10.25±2.11）歲。納入標準：①肥胖符合《中國兒童和青少年肥胖癥外科治療指南（2019 版）》[10]相關定義：體質量指數（BMI）>生長標準曲線的第95 百分位數；②年齡≤14 歲；③臨床資料完整，具備良好依從性；④兒童家長或監護人知情研究并簽署同意書。排除標準：①藥物、激素等其他原因引起的繼發性肥胖者；②合并先天性疾病者；③合并甲狀腺疾病者；④合并心、肝、腎等重要臟器損害者；⑤合并急慢性感染者；⑥血液系統異常者。另選取同期本院體檢的63 名健康兒童為對照組。其中，男性38 例，女性25 例；年齡7～14 歲，平均（10.17±2.08）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

收集所有兒童身高和體重資料，計算BMI=體重（kg）/身高（m2）。并采集肥胖兒童和正常兒童空腹肘靜脈血，3 000 r/min 離心10 min，半徑8 cm，取上清分為2 份，置于-80℃冰箱中待檢。

其中一份采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（fasting blood glucose,FBG），75 g 口服葡萄糖耐量試驗檢測空腹胰島素（fasting insulin,FINS），穩態模型胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=FBG （mmol/L） ×FINS （mIU/L）/22.5。AU5800 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司） 檢測總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、高密度脂 蛋 白 膽 固 醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）。Multiskan FC酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]檢測血清脂聯素、瘦素、抵抗素、內脂素、白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平，試劑盒均購自上海酶研生物科技有限公司。另一份采用Trizol 試劑盒（上海梵態生物科技有限公司）提取血清總RNA，Narodrop 分光光度計[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]驗證cDNA 濃度及純度，OD260/OD280 為1.8～2.0，TaKaRa 試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司）轉錄合成cDNA，使用qRT-PCR 儀（上海閎龍生物科技有限公司）和qRT-PCR 試劑盒（上海聯邁生物工程有限公司）進行qRT-PCR 擴增。miR-27a 正向引物：5'-TGCGCTTCACAGTGGCTAAGT-3'，反向引物：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'；內參U6 正向引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物： 5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'；PPAR-γ 正向引物：5'-CTGGCCTCCCTGATGAATAA-3'，反向引物：5'-CGCAGGTTTTTGAGGAACTC-3'；內參GAPDH 正向引物：5'-TGTGTCCGTCGTGGATC TGA-3'，反向引物：5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG AT-3'。10 μL 反應體系：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq；0.2 μL 引物；0.2 μL ROX 參考染料；1.0 μL cDNA 模板；3.4 μL 經DEPC 處理水。反應條件：95℃預變性90 s 循環1 次，95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s 循環40 次，制備熔解曲線。反應結束后得到各反應管Ct，采用2-ΔΔCt法計算血清miR-27a mRNA、PPAR-γ mRNA 相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）或中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，比較用t檢驗或秩和檢驗；計數資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗；相關分析用Pearson 或Spearman 法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組BMI、脂代謝指標、細胞因子水平比較

兩組BMI、脂代謝指標（除FBG 外）、細胞因子水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），肥胖組BMI、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內脂素、IL-6、TNF-α、miR-27a mRNA 高于對照組，HDL-C、脂聯素、PPAR-γ mRNA 低于對照組。兩組FBG 比較，差異無統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 肥胖組與對照組BMI、代謝指標、細胞因子水平比較

2.2 血清miR-27a mRNA、PPAR-γ mRNA 與BMI、脂代謝指標、細胞因子的相關性

Pearson/Spearman 相關性分析顯示，肥胖兒童血清miR-27a mRNA 與BMI、 FINS、 HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內脂素、IL-6、TNF- α 呈正相關（r/rs=0.607、 0.362、 0.466、0.435、0.542、0.450、0.546、0.558、0.437、0.633和0.559，均P<0.05），與HDL-C、脂聯素、PPAR-γ mRNA 呈負相關（r/rs=-0.686、-0.607 和-0.727，均P<0.05）；肥胖兒童血清PPAR-γ mRNA 與BMI、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內脂素、IL-6、TNF-α 呈負相關（r=-0.513、-0.328、-0.437、-0.340、-0.434、-0.411、-0.537、-0.514、-0.428、-0.547 和-0.509，均P<0.05），與HDL-C、脂聯素呈正相關（r=0.599 和0.527，P<0.05）。見表2。

表2 miR-27a mRNA、PPAR-γ mRNA與BMI、脂代謝指標、細胞因子的相關性

2.3 HOMA-IR 與血清脂代謝指標、細胞因子的相關性

肥胖兒童HOMA-IR 與TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內脂素、IL-6、TNF-α 呈正相關（r/rs=0.167、0.168、0.259、0.442、0.426、0.372、0.438和0.441，均P<0.05），與HDL-C、脂聯素呈負相關（r=-0.240 和-0.378，均P<0.05）。見表3。

表3 HOMA-IR與脂代謝指標、細胞因子的相關性

3 討論

兒童肥胖是由遺傳因素、環境因素等共同作用導致的一種獨立的慢性代謝性疾病，目前兒童肥胖形勢日益嚴峻，但相關干預和治療卻存在諸多挑戰，尚無充分證據證實外科手術減肥適用于肥胖兒童，其可能影響兒童的生長發育，而飲食和行為干預又很難達到顯著減肥效果，因此有必要進一步探索兒童肥胖相關機制。IR 為肥胖兒童常見代謝異常因素之一，實質為機體對能量過剩的一種代償反應機制，當機體儲存過多能量而肥胖時，胰島素不能發揮正常效應，對葡萄糖攝取和利用效率降低，機體代償性分泌過多胰島素以維持血糖穩定，是肥胖兒童心血管疾病發生的主要原因[11-12]。研究肥胖兒童IR 機制對降低體重和心血管疾病風險具有重要意義。

miRNA 是一類長度約22 個核苷酸的高度保守的內源性非編碼小分子單鏈非編碼RNA，能與靶mRNA 的3'非翻譯端相互作用，降解靶mRNA 或翻譯抑制，參與包括IR 等多種病理生理過程[13]。miR-27a 定位于人染色體19p13.12，在脂肪組織中高度表達，能作為負向調控劑促進脂肪細胞分化和脂質堆積，而脂肪過度積聚為肥胖者機體能量失衡的主要表現，因此miR-27a 被認為是肥胖相關miRNA[6-7]。本研究結果顯示，相比對照組，肥胖組血清miR-27a mRNA 相對表達量明顯升高，說明miR-27a 參與肥胖發生，分析原因與miR-27a 高表達參與脂肪過度積聚有關。同時本研究結果顯示，相比對照組，肥胖組FINS 和HOMA-IR 顯著升高，說明本組肥胖兒童存在明顯的IR，但兩組FBG 水平比較無差異，分析原因與肥胖兒童胰島素功能雖然受損，但還是能緩慢分泌胰島素降低血糖有關。作為肥胖相關miRNA，大量研究也報道了miR-27a 與IR 的關系，如YU 等[15]研究顯示，骨骼肌細胞中miR-27a 過表達可引起骨骼肌對葡萄糖消耗和攝取能力的降低，導致骨骼肌IR。骨骼肌是胰島素刺激葡萄糖吸收的主要效應器官，在維持機體血糖穩態中發揮重要調節作用，miR-27a 過表達能引起骨骼肌IR 提示miR-27a 參與IR 過程。本研究結果顯示，肥胖兒童血清miR-27a 與FINS、HOMA-IR 呈正相關，說明肥胖兒童血清miR-27a升高與IR 發生有關。脂肪組織是一個代謝和免疫功能活躍的器官，能特異性分泌大量具備活性的TC、TG、HDL-C、LDL-C、脂聯素、瘦素、抵抗素、內脂素等脂肪因子，以及IL-6、TNF-α 等前炎癥因子。肥胖狀態下脂肪細胞體積變大和脂肪組織血流量異常等可引起脂肪因子和前炎癥因子異常表達，前炎癥因子能直接抑制胰島素信號傳導導致IR，脂肪因子代謝紊亂可導致大量脂肪堆積于肌肉、肝臟、β 細胞，引起胰島細胞功能障礙和IR[16-17]。本研究結果顯示，與對照組相比，肥胖組TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內脂素、IL-6、TNF-α 水平升高，而HDL-C、脂聯素水平降低，說明肥胖兒童存在明顯脂代謝異常和炎癥反應，與既往報道一致[18]。相關性分析表明HOMA-IR 與脂代謝異常和炎癥反應相關，說明miR-27a mRNA高表達可能通過脂代謝異常和炎癥反應參與肥胖兒童IR。

PPAR-γ 是一種核激素受體因子，具備轉錄激活和轉錄抑制的作用，初始研究認為其僅能調控脂肪細胞分化，在脂質裂解和代謝中發揮重要作用，近年研究表明，PPAR-γ 還能通過調控葡萄糖轉運蛋白4、胰島素受體底物等改善IR，同時PPAR-γ 也能通過控制脂肪組織分泌脂肪因子和前炎癥因子改善胰島素敏感性[8]。本研究結果顯示，相比對照組，肥胖組血清PPAR-γ mRNA 相對表達量明顯降低，說明PPAR-γ 參與肥胖發生，分析原因與PPAR-γ 參與脂質裂解和代謝有關，PPAR-γ表達降低會抑制其裂解和代謝脂質作用，導致脂肪過度積聚引起肥胖。結果還顯示，肥胖兒童血清PPAR-γ 與FINS、HOMA-IR 呈負相關，說明肥胖兒童血清PPAR-γ 表達降低與IR 發生有關，與既往報道一致[8]。相關性分析也說明PPAR-γ mRNA 相對表達量降低可能通過脂代謝異常和炎癥反應參與肥胖兒童IR。生物信息學預測結果表明，miR-27a 可結合PPAR-γ mRNA 的3'非翻譯端，抑制PPAR-γ mRNA 表達，近年多項研究通過熒光報告素酶實驗也證實miR-27a 能靶向抑制PPAR-γ mRNA 表達，從而發揮其生物學作用，如DENG 等[19]在綿羊脂肪生成研究中發現，過表達miR-27a 能通過下調PPAR-γ 促進脂肪細胞分化和聚集。CHEN等[20]在小鼠肥胖和脂肪細胞IR 模型研究中發現，過表達miR-27a 能通過下調PPAR-γ 降低脂肪細胞對葡萄糖的攝取和利用，并下調胰島素敏感性。本研究結果也顯示，肥胖兒童血清miR-27a mRNA與PPAR-γmRNA 呈負相關，因此可推測肥胖兒童血清miR-27a mRNA 高表達可能通過抑制PPAR-γ mRNA 表達導致IR，但該結論還需進一步實驗驗證。

綜上所述，肥胖兒童血清miR-27a mRNA 高表達、PPAR-γ mRNA 低表達，兩者與IR 密切相關。但本研究樣本量較少，關于miR-27a 和PPAR-γ 參與肥胖兒童IR 的機制有待研究驗證，后續研究將進一步探討二者與肥胖兒童預后的關系。