不同干燥條件及部位對抱莖小苦荬總黃酮的影響*

趙夢琪，王科棟，李克杰，石路德

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355；3 濟(jì)南市商河縣中醫(yī)院，山東 濟(jì)南 251600)

抱莖小苦荬(IxerissonchifoliaBge.Hance)為小苦荬屬植物，全草可入藥，具有清熱解毒，涼血活血之功效，可用于治療無名腫痛、乳癰癤腫、闌尾炎、肝炎等各種炎癥以及肺熱咳嗽、肺結(jié)核等[1]。抱莖苦荬菜化學(xué)成分研究顯示其含有黃酮類、木質(zhì)素類、皂苷類、酚酸類及揮發(fā)油類成分[2-5]，其化學(xué)成分以黃酮類物質(zhì)含量最高[6]，已報(bào)道從抱莖小苦荬中分離得到130個(gè)化學(xué)成分，包括黃酮類、倍半萜類、三萜類、苯丙素類、有機(jī)酸類等。它們表現(xiàn)出多種藥理活性，如保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗癌作用和抗病毒等[7]。因此，本文對其不同干燥溫度下不同生長部位總黃酮進(jìn)行含量測定研究，以期為抱莖小苦荬臨床用藥提供一定的干燥加工數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

METASH(X-5)型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；KQ-500GVDV型雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHK-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；精密電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；QE-300型高速粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司；40目分樣篩，浙江上虞市金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠，其他容量儀器均經(jīng)矯正。

抱莖小苦荬藥材，采于山東中醫(yī)藥大學(xué)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)孫稚穎教授鑒定為抱莖小苦荬(IxerissonchifoliaBge.Hance)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)，上海源葉生物科技有限公司，所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)植株部位分為去根植株組、凈根組、全植株組三大組，根據(jù)干燥條件細(xì)分為曬干組、60 ℃烘干組、80 ℃烘干組，如表1所示：

表1 干燥條件與植株部位實(shí)驗(yàn)分組表Table 1 Experimental grouping table of drying conditions and plant parts

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，加入5滴乙醇溶解，加入60%乙醇定容至25 mL，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 供試品溶液制備

精密稱取粉碎的抱莖小苦荬0.5 g，置于磨口三角瓶中，精密加入60%乙醇溶液40 mL，50 ℃、45 kHz、100%功率超聲提取60 min，經(jīng)抽濾得提取液，置于50 mL容量瓶用60%乙醇溶液定容備用。

1.5 總黃酮含量測定方法

精密量取供試品溶液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，靜置5 min，再加入10%硝酸鋁 1 mL，搖勻，靜置5 min，最后加入4%氫氧化鈉4 mL，加入60%的乙醇稀釋至刻度定容，搖勻，靜置15 min。以相應(yīng)試劑為空白，用紫外分光光度法測定。

1.6 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基溶液配制：取一定量DPPH，用無水乙醇配制成質(zhì)量濃度0.04 mg/mL的溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)；

樣品溶液配制：分別取不同干燥方式下的去根樣品、根樣品和全株樣品采用“1.3”方法用無水乙醇配制樣品溶液；

按2 mL無水乙醇+2 mL DPPH自由基溶液；2 mL樣品溶液+2 mL DPPH自由基溶液；2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇溶液加入反應(yīng)液，搖勻后于室溫避光靜止30 min，轉(zhuǎn)移至比色皿內(nèi)以無水乙醇作空白分別在517 nm處[8]測吸光度。每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算個(gè)樣品對DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除計(jì)算公式一般為：

式中：As為樣品溶液與DPPH自由基溶液組的吸光度；Ac為樣品溶液與無水乙醇組的吸光度；Ab為無水乙醇與DPPH自由基溶液組的吸光度。

陽性對照的測定：稱取0.01 g維生素C，蒸餾水定容至 50 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度0.20 mg/mL溶液。分別取 0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻。按樣品溶液的測定方法進(jìn)行測定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥條件下藥材介紹

曬干條件：色澤最暗，呈現(xiàn)褐綠色，氣味最淡，如圖1A所示。

80 ℃烘干條件：色澤黯淡，呈現(xiàn)灰綠色，氣味最濃，如圖1B所示。

60 ℃烘干條件：色澤較黯淡，呈現(xiàn)暗綠色，氣味較淡，如圖1C所示。

圖1 不同干燥條件下抱莖小苦荬樣本Fig.1 Samples of Ixeris sonchifolia under different drying conditions

2.2 測定波長的選擇

精密吸取2 mL供試品溶液于25 mL容量瓶中，加10%硝酸鋁1 mL，搖勻，靜置5 min，加4%氫氧化鈉4 mL，加入60%的乙醇稀釋至刻度定容，搖勻，靜置15 min，制備成樣品溶液，置于具塞試管中，以相應(yīng)試劑為空白，于紫外分光光度計(jì)上在190～800 nm內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果樣品顯色液在510 nm處有最大吸收峰，因此選擇510 nm作為抱莖小苦荬總黃酮測定的最佳吸收波長。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、 2.0 mL、2.5 mL和3.0 mL置于25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，靜置5 min，加10%硝酸鋁1 mL，搖勻，靜置5 min，加4%氫氧化鈉4 mL，加入60%的乙醇稀釋至刻度定容，搖勻，靜置15 min，以試劑為空白，于510 nm處測定吸光度，以蘆丁對照品溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以吸光度對濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=12.811X-0.2595，γ=0.9998，表明：蘆丁對照品溶液在0.02352～0.04704 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，如圖2、表3所示。

表2 總黃酮測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 2 Standard curve data for determination of total flavonoids

圖2 總黃酮測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for determination of total flavonoids

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取QZ-S組供試品溶液2.0 mL，按照“1.4”所述方法進(jìn)行顯色，并測定溶液吸光度值，連續(xù)測定6次，得RSD值。結(jié)果得RSD值為0.03%，表明儀器精密性良好，如表3所示。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision test results

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取QZ-80組供試品溶液1.0 mL，按照“1.4”所述方法進(jìn)行顯色，并測定溶液吸光度值，平行測定5份，得RSD值。結(jié)果得RSD值為2.40%，表明此實(shí)驗(yàn)方法可靠，如表4所示。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repeatability test results

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取QZ-60組供試品溶液2.0 mL，按照“1.4”所述方法進(jìn)行顯色，分別在0、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min 測定溶液的吸光度值。結(jié)果得RSD值為2.02%，表明樣品溶液穩(wěn)定，如表5所示。

表5 不同時(shí)間測定樣品中總黃酮的吸光度值Table 5 Determination of absorbance value of total flavonoids in samples at different time points

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱定QG-80組抱莖小苦荬粉末0.5 g共5份，配制成供試品溶液，各取2 mL放于5個(gè)25 mL容量瓶中，分別加入“1.2”項(xiàng)下制備所得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mL(蘆丁含量為0.1 mg)，加入60%乙醇定容至刻度，精密量取2.5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，按“1.4”所述方法進(jìn)行顯色，并測定吸光度值，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果得均回收率為87.39%，回收率較好，如表6所示。

表6 回收率測定結(jié)果Table 1 Determination results of recovery rate

2.8 測定方法

取抱莖小苦荬粉末粉末適量，精密稱定，按設(shè)定的條件進(jìn)行超聲提取后，濾過，置于50 mL容量瓶定容，精密量取續(xù)濾液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，靜置5 min，加10%硝酸鋁1 mL，搖勻，靜置5 min，加4%氫氧化鈉4 mL，加入60%的乙醇稀釋至刻度定容，搖勻，靜置15 min，于510 nm處測定吸光度，用回歸方程計(jì)算總黃酮的含量。

2.9 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表7 抱莖小苦荬不同干燥條件不同部位總黃酮含量及DPPH清除率Table 7 Total flavonoids content and DPPH scavenging rate in different parts of Ixeris sonchifolia under different drying conditions

2.10 相關(guān)性分析

現(xiàn)代研究表明抗氧化活性與植物體中多酚和總黃酮含量有密切的關(guān)系[10]。因此對抱莖小苦荬不同部位總黃酮含量與DPPH清除率進(jìn)行相關(guān)性分析，DPPH體系與總黃酮含量相關(guān)系數(shù)R為0.916，說明總黃酮是DPPH自由基清除能力的影響因素。

表8 總黃酮含量與DPPH抗氧化方法間的相關(guān)性Table 8 Correlation between total flavonoids content and DPPH antioxidant method

3 結(jié) 論

抱莖小苦荬有三萜、甾醇、倍半萜、黃酮、香豆素等多種化學(xué)成分[11]，其總黃酮含量是評價(jià)藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。抱莖小苦荬已經(jīng)被開發(fā)為多種臨床試劑，由抱莖苦荬菜為原料提取精制而成的靜脈注射制劑苦碟子注射液，主要成分為腺苷及黃酮類物質(zhì)[12]，能夠有效增加心腦血流量，預(yù)防缺血損傷，擴(kuò)裝冠狀動(dòng)脈血流量，提高心肌的供血和供氧能力[13]，本文對抱莖小苦荬不同干燥條件下不同生長部位的總黃酮含量以及抗氧化活性進(jìn)行測定研究后發(fā)現(xiàn)：抱莖小苦荬總黃酮含量大小的順序?yàn)椋喝ジ?全草>根，DPPH自由基清除率大小依次為：去根>全草>根。多項(xiàng)研究表明，黃酮中酚羥基結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，對活性氧等自由基具有很強(qiáng)的捕捉能力[14]，通過相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，各部位提取液抗氧化活性與總黃酮含量之間有明顯的相關(guān)性，說明總黃酮為抱莖小苦荬提取液清除自由基作用的主要影響因素。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，抱莖小苦荬在曬干干燥條件下總黃酮含量更高，抱莖小苦荬的去根部分總黃酮含量所占比例更高，為其資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。