新型脯氨醇N-氧化物類HDAC抑制劑的設計合成*

陳 蕾，支泰雷，李 燕，李勇軍，何 彬

(1 貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2 貴州醫科大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550004；3 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

腫瘤是一類嚴重威脅人類健康與生命的重大疾病。由于腫瘤的發病機理錯綜復雜，針對腫瘤的藥物作用靶點很多。近年來，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)成為抗腫瘤藥物作用的重要靶點。HDACs是一類廣泛存在于真核細胞中的蛋白酶，參與染色體的結構修飾和對其他功能蛋白的條件[1-2]，在基因表達[3]、細胞生長[4]、分化和凋亡[5]中發揮著重要的作用。因此，以HDACs為靶點設計小分子抑制劑被視為治療腫瘤的一個有效策略。HDAC抑制劑已成為一種具有良好前景的抗腫瘤藥物。2006年12月，FDA批準SAHA(Suberoylanilide hydroxamic acid， Vorinostat)上市。這是第一個上市的HDAC抑制劑，用于治療皮膚T淋巴細胞淋巴瘤。西達本胺(Chidamide，商品名愛譜沙/epidaza)屬于全新作用機制的綜合靶向抗腫瘤靶向藥物，于2015年1月獲準全球首個獲準上市的亞型選擇性組蛋白去乙酰化酶口服抑制劑，廣泛用于臨床治療。

根據他們與酵母HDACs的同源性、細胞內定位和組織分布特異性又可分為四種類型：Class I，Class Ⅱ，Class Ⅲ，ClassⅣ，如圖1所示。其中Class I，Class Ⅱ，ClassⅣ是最基本的組蛋白去乙酰化酶，共包括11個亞型。Class I 包括HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8亞型；Class Ⅱ包括HDAC4-7，9-10亞型；ClassⅣ包括HDAC11亞型。Class Ⅲ是基于酵母Sirt2的類似蛋白。Class I，Class Ⅱ，ClassⅣ三類是Zn2+的酶，在其底部有一個含Zn2+的催化口袋，可以結合鋅離子螯合基團(ZBG)[6-8]。

圖1 HDACs家族[8]Fig.1 HDAC family

HDACs抑制劑能夠抑制HDACs活性，增加組蛋白乙酰化程度，提高抑癌基因表達水平，因此，能夠抑制腫瘤細胞的增殖、誘導細胞分化和凋亡[9-10]。X-射線晶體衍射法結構分析HDACIs具有三個功能區域：(1)鋅離子結合區(zinc binding group，ZBG)與酶的活性位點的Zn2+，并與活性中心氨基酸作用；(2)連接器(linker)占據活性位點的狹長的通道，它的鏈長直接影響到鋅離子結合區與的結合情況；(3)表面識別區(cap group)與酶活性口袋邊緣的氨基酸殘基作用，決定抑制劑分子對酶的識別及結合程度，輔助鋅離子結合區與Zn2+螯合[8，11]。

作為第一個被美國食品藥物管理局(FDA)批準上市的HDACI，化合物SAHA(suberanilohydroxamic acid)具有較高的酶抑制活性，對Ⅰ類和Ⅱ類HDACs均具有很好的抑制效果。另一個上市的藥物FK228，其二硫鍵在體內水解為巰基，作為抑制劑的鋅離子結合區與酶活性中心Zn2+和氨基酸作用[11]，如圖2所示。

圖2 SAHA和FK228的結構Fig.2 Structure of SAHA and FK228

圖3 新型脯氨酸抑制劑5的合成路線Fig.3 Synthetic route of new proline inhibitor 5

分別以4-溴丁酸，6-溴己酸，8-溴辛酸為原料，設計合成一系列的可能具有良好活性的N-氧化物類HDAC抑制劑，探索ZBG和Linker的變化導致的活性變化，如圖3所示。并可從中尋找活性較好的藥物作為先導化合物進行結構修飾和改造，為后續合成打好鋪墊。

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

WGLL-125BE 鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限責任公司；GB3002 電子天平，METTLER TOLEDO；EYELA N-1100 旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；JNM-ECS400 核磁共振測試儀，JEOL公司；UHPLC-MicroTOF-QⅡ 高分辨質譜儀，Bruker Daltonics公司；XODC-0506 低溫恒溫槽，南京先歐儀器制造有限公司；B11-1 控溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；2XZ-1 智能真空泵，浙江黃巖黎明有限公司。其他：茄形瓶，恒壓滴液漏斗，分液漏斗，水浴鍋，燒杯，量筒，滴管，結晶濾頭，移液管等。

1.2 試 劑

4-溴丁酸(98%)、6-溴己酸(98%)、8-溴辛酸(98%)、苯胺(99%)、碘化鈉(99%)，阿拉丁試劑；二氯亞砜、DCC(二環己基碳二亞胺)、DIEA(N，N-二異丙基乙胺)、L-脯氨醇、(S)-(-)-α，α-二苯基脯氨醇、K2CO3、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，廣東光華科技股份有限公司；THF(四氫呋喃)、m-MCPA(間氯過氧苯甲酸)、柱層析硅膠(200-300目，100-200目)、薄層層析硅膠GF254、實驗所用試劑或溶劑在反應前均按反應要求進行預處理，所有起始原料均為市售化學純或試劑純。

2 方法與結果

2.1 化合物2的制備

在100 mL的茄形瓶加入1.0 g的4-溴丁酸1a，適量THF作為反應溶劑，冰浴下滴加1.2 eq的二氯亞砜，常溫下反應 2 h后，再加入1.2 eq的苯胺，約2 h后監測反應完全，將反應體系中的溶劑減壓蒸餾除去，用二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗多次，無水硫酸鈉干燥。得到油狀混合物2.5 g。采用石油醚：乙酸乙酯=10:1極性的洗脫劑進行洗脫。得到2a為720 mg。收率為50%。1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.50(d， 2H)； 7.29(m， 2H)； 7.117(t， 1H)； 3.64(m， 2H)； 2.49(m， 2H)； 1.19(m， 2H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)δ 129.04， 124.40， 119.73， 50.90， 44.48， 34.09， 27.83。

取100 mL的茄形瓶，加入1.0 g 6-溴己酸1b，1.2 eq的苯胺，以及1.2 eq的DCC和1.2 eq的N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，加入5 mL 的四氫呋喃，常溫下反應5 h，TLC監測反應完全。將反應體系中溶劑減壓蒸盡，采用500 mL二氯甲烷萃取，100 mL飽和食鹽水洗4次。收集有機層，采用無水Na2SO4干燥。采用柱層析石油醚:乙酸乙酯=15:1的洗脫劑分離得到1.4 g淺黃白色固體的化合物2b，收率為86%。1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.48(d， 2H)； 7.31(d， 2H)； 7.09(m， 1H)； 3.409(t， 2H)； 2.38(t， 2H)； 1.87(m， 2H)； 1.75(m， 2H)； 1.54(m， 2H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)δ 129.02， 124.26， 119.70， 37.45， 33.65， 32.42， 27.70， 24.59。

取100 mL的茄形瓶，加入1.0 g 8-溴辛酸1c，1.2 eq的苯胺，以及1.2 eq的DCC和1.2 eq的DIEA，采用THF作為反應溶劑，常溫下反應5 h，TLC監測反應完全。將反應體系中溶劑減壓蒸盡，采用500 mL二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗 (100 mL×4)。收集有機層，采用無水Na2SO4干燥，采用石油醚:EtOAc=10:1的洗脫劑洗脫，得到化合物2c為0.75 g。收率為56%。1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.49(d， 2H)； 7.28(d， 2H)； 7.10(m， 1H)； 3.37(m， 2H)； 2.34(m， 2H)； 1.87(m， 2H)； 1.70(m， 2H)； 1.35(m， 5H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)130.09， 124.20， 119.67， 50.91， 37.72， 33.98， 32.65， 29.01， 28.49， 27.94， 25.41。

2.2 化合物4的制備

在化合物2a中加入1.2 eq的L-脯氨醇3a或3b，2.0 eq的K2CO3以及1.0 eq的NaI，采用DMF作為溶劑，50～70 ℃條件下反應，約6 h后TLC監測反應完全。將反應體系中溶劑減壓蒸餾，采用乙酸乙酯萃取，飽和NaCl水溶液多次洗，采用無水Na2SO4干燥，得到油狀混合物，采用二氯甲烷:甲醇=10:1得到化合物4aa為108 mg。收率為50%。1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.64(m， 2H)； 7.24(m， 2H)； 7.07(m， 1H)； 3.99(m， 1H)； 3.90(m， 2H)； 3.67(m， 2H)； 3.49(m， 2H)； 3.14(m， 1H)； 2.81(m， 2H)； 1.91(m， 2H)； 1.23(s， 2H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)171.02， 138.5， 128.90， 124.55， 120.22， 70.54， 59.92， 56.67， 55.00， 34.25， 26.38， 23.45， 21.40；HRMS(ESI)m/z： Calculated for C15H22N2O2[M+H]+263.2651， found 262.2681。 采用二氯甲烷:甲醇=20:1洗脫，得到化合物4ab為171 mg。收率為41%。1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.62(d， 1H)； 7.50(m， 2H)； 7.27(m， 8H)； 7.20(s， 1H)； 7.09(m， 2H)； 4.41(m， 1H)； 3.68(s， 1H)； 2.38(m， 1H)； 2.08(m， 2H)； 1.96(dd， 2H)； 1.86(m， 2H)； 1.24(s， 3H)； 0.85(m， 1H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)171.70， 138.41， 129.32， 129.27， 129.20， 126.37， 56.32， 33.27， 29.17， 26.40， 24.30; HRMS(ESI)m/z： Calculated for C27H30N2O2[M+H]+415.2382， found 414.2307。

取50 mL的茄形瓶 在200 mg化合物2b中加入1.2 eq的L-脯氨醇(3a或3b)，2.0 eq的K2CO3以及1.0 eq的NaI，采用DMF作為溶劑，60 ℃條件下反應，約6 h后TLC監測反應完全。將反應體系中溶劑減壓蒸餾，水洗多次，乙酸乙酯萃取，用無水Na2SO4干燥，柱層析分離純化，使用二氯甲烷:甲醇=(30:1)～(15:1)的洗脫劑進行梯度洗脫，分離得到化合物4ba為201 mg，收率93%。分離得到化合物4bb為270 mg，收率82%。化合物4ba：HRMS(ESI)m/z： Calculated for C17H26N2O2[M+H]+290.1994， found 291.1954。化合物4bb：235 mg。收率為75%。HRMS(ESI)m/z： Calculated for C29H34N2O2[M+H]+442.2620， found 443.2529。

取50 mL的茄形瓶 在200 mg化合物2c中加入1.2 eq的 L-脯氨醇(3a或3b)，2.0 eq的K2CO3以及1.0 eq的NaI，采用DMF作為溶劑，60 ℃條件下反應，約6 h后TLC監測反應完全。將反應體系中溶劑減壓蒸餾，水洗多次，乙酸乙酯萃取，用無水Na2SO4干燥，柱層析分離純化，使用二氯甲烷:甲醇=(40:1)～(25:1)的洗脫劑進行梯度洗脫，分離得到化合物4ca為181 mg，收率85%。分離得到化合物4cb為235 mg，收率75%。化合物4ca：1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.97(s， 1H)； 7.59(d， 2H)； 7.240(d， 2H)； 7.04(m， 1H)； 3.93(m， 2H)； 3.85(s， 1H)； 3.50(s， 1H)； 3.31(s， 1H)； 2.86(m， 2H)； 2.37(t， 2H)； 2.123(m， 3H)； 1.70(t， 3H)； 1.36(s， 6H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)171.89， 139.22， 128.85， 123.97， 119.79， 60.15， 54.61， 37.47， 28.21， 27.92， 26.38， 25.97， 25.08， 24.99， 23.67; HRMS(ESI)m/z： Calculated for C19H30N2O2[M+H]+318.2307， found 319.2358。 化合物4cb：235 mg。收率為75%。1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)：7.61(m， 6H)； 7.30(m， 8H)； 7.19(m， 2H)； 3.2(s， 1H)； 2.3(s， 4H)； 1.9(s， 4H)； 1.7(s， 7H)； 1.12(m， 4H)；13C-NMR(300 MHz， CDCl3)：171.89， 139.22， 128.94， 128.09， 126.38， 125.65， 125.47， 124.04， 119.68， 37.660， 33.913， 29.20， 26.36， 25.56， 24.91 ，24.26； HRMS(ESI)m/z： Calculated for C31H38N2O2[M+H]+471.2921， found 470.2933。

2.3 化合物5的制備

將50 mg的化合物(4aa、4ab、4ba、4bb、4ca、4cb)置于 25 mL的茄形瓶中，加入1.0 eq 的m-CPBA(間氯過氧苯甲酸)，2.0 eq 的K2CO3。采用THF作為反應溶劑，冰浴下反應約10 min后，TLC監測反應完全，將反應體系中溶劑減壓蒸餾完畢后，采用二氯甲烷萃取，飽和NaCl溶液水洗，無水Na2SO4干燥。采用二氯甲烷:甲醇=20:1的極性的洗脫劑進行洗脫，濃縮得到化合物5aa為24 mg，收率46%。化合物5ba：1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.90(s， 1H)； 7.56(d， 2H)； 7.30(m， 3H)；7.04(s， 1H)； 4.25(m， 2H)； 3.89(d， 1H)；3.73(m， 3H)；2.26(m， 3H)；2.03(m， 4H)；1.83(d， 2H)；1.63(t， 2H)； 1.22(d， 7H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)： 170.20， 138.17， 128.11， 128.03， 121.60， 71.34， 61.17， 38.40， 26.17， 25.32， 23.12， 19.44; HRMS(ESI)m/z： Calculated for C19H30N2O3[M+H]+334.2256， found 335.2227。

二氯甲烷:甲醇=40:1，濃縮得到化合物5bb為23 mg，收率為44%。化合物5b：1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.61(m， 6H)； 7.30(m， 8H)； 7.19(m， 2H)； 3.2(s， 1H)； 2.3(s， 4H)； 1.9(s， 4H)； 1.7(s， 7H)； 1.12(m， 4H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)： 171.85， 130.28， 129.15， 128.42， 127.03， 124.93， 119.96， 77.99， 77.55， 77.07， 68.76， 38.30， 28.58， 28.19， 26.33， 25.43， 20.25; HRMS(ESI)m/z： Calculated for C31H38N2O3[M+H]+486.2882， found 487.2944。

二氯甲烷:甲醇=20:1的極性的洗脫劑進行洗脫，濃縮得到化合物5ca為24 mg，收率為46%。HRMS(ESI)m/z： Calculated for C19H30N2O3[M+H]+335.2227， 334.2256。

二氯甲烷:甲醇=40:1洗脫，濃縮得到5cb為23 mg。收率為44%。1H-NMR(400 MHz， CDCl3)δ(ppm)7.61(m， 6H)； 7.30(m， 8H)； 7.19(m， 2H)； 3.2(s， 1H)； 2.3(s， 4H)； 1.9(s， 4H)； 1.7(s， 7H)； 1.12(m， 4H);13C-NMR(100 MHz， CDCl3)： 171.85， 130.28， 129.15， 128.42， 127.03， 124.93， 119.96， 77.99， 77.55， 77.07， 68.76， 38.30， 28.58， 28.19， 26.33， 25.43， 20.25; HRMS(ESI)m/z： Calculated for C31H38N2O3[M+H]+487.2944， found 486.2882。

3 結 論

通過考察不同linker鏈長的HDAC抑制劑，首先以4-溴丁酸，6-溴己酸，8-溴辛酸為起始原料，采用幾步簡單的酰胺縮合反應、取代反應和過氧化反應后即可制備得到R基團分別由氫原子和苯基兩種不同取代的新型N-氧化物脯氨醇類HDAC抑制劑，目標化合物經過核磁共振和高分辨質譜(1H-NMR、13C-NMR、 HRMS)的圖譜分析確證。該合成方法簡單、操作性強、原料易得，期望進行活性測試后來篩選得到活性更好的目標產物，為后續發展新型的HDAC抑制劑奠定基礎。