高效液相色譜法測定職業性有害因素尿素的方法確認

郭德鵬，李 強

(西山煤電(集團)有限責任公司職業病防治所，山西 太原 030053)

尿素又稱為碳酰胺，白色晶體，是一種低毒化學物質，易溶于水。尿素是固態氮肥中含氨量最高的一種氮肥，在尿素的生產、運輸和使用過程中，尿素粉塵大量的存在于工作場所的空氣中，是工作場所空氣中常見的職業性有害因素。長期接觸尿素能引起人的呼吸系統疾病及腎病，刺激眼睛和皮膚，危害人體健康。工作場所空氣中尿素的含量是評價工作場所空氣質量和職業病診斷的重要依據。高效液相色譜法以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。具有分離效能高、靈敏度高、分析速度快、應用范圍廣的特點，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出很大的優勢。工作場所空氣中的尿素測定目前尚無現行有效檢測標準，有研究顯示工作場所空氣中尿素粉塵采用對二甲氨基苯甲醛分光光度法測定[1]，雖具有較好的線性，但是此法檢出限及最低檢出濃度偏高，存在較大的檢測誤區。本次實驗空氣中尿素用玻璃纖維濾膜采集，乙腈水溶液洗脫后進樣，經ODS HYPER Sil色譜柱分離，紫外檢測器檢測，以保留時間定性，峰高或峰面積定量。方法根據尿素的性質，對工作場所空氣中尿素的測定方法進行了研究，克服了檢出限及最低檢出濃度偏高的不足，各項指標能夠滿足檢測要求。

1 材料方法

1.1 儀器及工作條件

1200型液相色譜儀，美國安捷倫，帶紫外檢測器；色譜柱：ODS HYPER Sil色譜柱，長度：250 mm；直徑：4.6 mm；膜厚：5 μm，柱溫：40 ℃；檢測波長：190 nm；進樣體積為20 μL；流動相流速：1.0 mL/min[2]。

1.2 試劑及材料

實驗用水為一級水；采樣介質為玻璃纖維濾膜[3]；流動相溶液(乙腈:水=5:95)：取50 mL 乙腈(色譜純)用水稀釋至1000 mL；標準品：尿素純度標準物質(GBW(E)0921，13001，99.8%，中國計量科學研究院)；尿素標準儲備液：準確稱量100 mg尿素純度標準物質，加水溶解，轉移入100 mL潔凈干燥的容量瓶中，用水定容，配成尿素標準儲備液，標準值為1.0 mg/mL；尿素加標儲備液：稱量200 mg尿素純度標準物質，加水溶解，轉移入10 mL潔凈干燥的容量瓶中，加水定容，配成濃度為20 mg/mL的尿素加標儲備液。

1.3 采 樣

在采樣點，將裝有玻璃纖維濾膜的采樣夾放入采樣頭，安裝在大氣采樣器上，調整采樣器流量為5 L/min，采集15 min空氣樣品。注意采樣高度為呼吸帶高度。采樣結束，用鑷子將玻璃纖維濾膜取出，接塵面朝里對折兩次，置清潔容器內運輸和保存[4]。

1.4 樣品處理

將采樣后的玻璃纖維濾膜放入10 mL具塞刻度試管中，加入10.0 mL 洗脫液(乙腈:水=5:95)，超聲3 min，洗脫液過濾后供測定。

1.5 標準曲線

用洗脫液稀釋尿素標準儲備液，配置濃度為0.0、20.0、40.0、80.0、120.0、200.0 μg/mL的尿素標準系列。

打開安捷倫1200高效液相色譜儀工作站，按照儀器工作條件設置，將儀器調節至最佳測定狀態，進樣20 μL。測定標準系列，每個濃度測定3次。以峰面積均值對相應的尿素濃度(μg/mL)繪制標準曲線。

1.6 樣品測定

在相同條件下測定樣品和空白洗脫液，測得樣品的峰面積值減去空白對照的峰面積值后，由標準曲線計算樣品的濃度(μg/mL)。

1.7 計 算[5]

按式(1)將采樣體積換算成標準采樣體積：

(1)

式中：V0——標準采樣體積，L

V——實際采樣體積，L

t——采樣時的溫度，℃

P——采樣時的大氣壓，kPa

按式(2)計算空氣中尿素的濃度：

(2)

式中：C——空氣中尿素的濃度，mg/m3

c——測得洗脫液中尿素的濃度，μg/mL

10——洗脫液的體積，mL

V0——標準采樣體積，L

D——洗脫效率，%

2 結果討論

2.1 保留時間

保留時間用于尿素的定性，實驗中，尿素的保留時間為1.418 min，見圖1所示。實驗選用乙腈的水溶液作為流動相，且當乙腈與水的體積比為5:95，流動相流速為1.0 mL/min時，尿素樣品經液相色譜檢測的峰型最佳，無溶劑干擾，出峰時間適中，檢測效率最高。

圖1 尿素保留時間Fig.1 Retention time of urea

2.2 方法的線性

實驗配制了濃度為0.0、20.0、40.0、80.0、120.0、 200.0 μg/mL的尿素標準系列，每個標準溶液進樣3次，計算峰面積平均值，以每個標準溶液測得的峰面積均值對尿素的濃度(μg/mL)繪制標準曲線。計算標準曲線為Y=5.9779X+10.5930，相關系數r=0.9996，線性范圍為0～200 μg/mL，滿足方法檢測要求。標準曲線見圖2所示。標準曲線是描述被測物質的濃度或含量與分析儀器響應信號值之間定量關系的曲線，其三個參數分別是，相關系數r，斜率b和截距a。相關系數是表示變量濃度與響應信號峰面積之間線性關系的密切程度，通常要求r≥0.999，此時表明線性關系良好；相關系數小于0.999時，實驗準確度降低，應查找原因。斜率b表示該分析方法的靈敏度，在實驗條件基本一致的情況下，標注曲線的斜率b應當保持相對穩定。截距a常用于評價標準曲線的準確度，a值過大會影響實驗的準確度。系統誤差、隨機誤差及試劑空白是引起截距偏大的主要原因。本實驗標準曲線相關參數均符合要求，數據準確。

圖2 尿素標準曲線Fig.2 Standard curve of urea

2.3 方法檢出限和方法定量下限

檢出限是測定方法在給定的概率P=95%(顯著水準為5%)時能夠定性檢出樣品中待測物的最低濃度或含量，是評價分析方法及測試儀器性能的重要指標。定量下限是測定方法能夠定量檢測樣品中待測物的最低濃度或含量，是反映分析方法能夠準確定量測定低濃度水平待測物質的可能性。根據GBZ/T 210.4-2008中對方法檢出限和方法定量下限的技術要求[6]，將接近空白濃度的溶液連續測定10次。經計算得本法檢出限為0.4 μg/mL(以3倍標準差計算)，定量下限為1.2 μg/mL(以10倍標準差計算)；定量測定范圍為1.2～200.0 μg/mL。

2.4 批間精密度

批間精密度是在再現性測量條件下獲得的測量精密度，根據待測化學有害因素的職業接觸限值設計加標量，批間標準偏差應小于10%。工作場所空氣中尿素的時間加權平均容許濃度PC-TWA為5 mg/m3，短時間接觸容許濃度PC-STEL為10 mg/m3。在空氣中尿素濃度為10 mg/m3時，采樣體積以75 L計，玻璃纖維濾膜上尿素的量為750 μg。在曲線范圍內選擇低、中、高濃度，尿素檢測確認劑量水平為200 μg、1000 μg、1800 μg。取18張空白玻璃纖維濾膜，分成3組，每組6張。分別加入相當于20 μg/mL(10 μL)、100 μg/mL (50 μL)、180 μg/mL (90 μL)的尿素加標儲備液作為低、中、高濃度加標組[7]，室溫下密閉放置過夜，分別在第一天、第二天、第三天按方法處理后進樣測定。其相對標準偏差(RSD)為2.5%～2.7%，結果見表1所示。

表1 批間精密度試驗結果(n=6)Table 1 Between-run precision(n=6)

2.5 洗脫效率、準確度和批內精密度

洗脫效率溶劑洗脫后檢測到待測物的量與濾膜中吸附的待測物的量的百分比，常采用定量加入與檢測結果的方法進行評價。準確度采用樣品溶液加標回收率的方式進行評估，方法的加標回收率達到90%～105%為宜。按照洗脫效率制備不同劑量水平的模擬樣品，同一批次檢測的結果用于批內精密度的評估。用相對標準偏差表述，批內標準偏差應小于10%。取18張玻璃纖維濾膜，分成3組，每組6張[8]。分別加入相當于 20 μg/mL(10 μL)、100 μg/mL (50 μL)、180 μg/mL (90 μL)的尿素加標儲備液作為低、中、高濃度加標組，室溫下放置過夜，按方法處理后進樣，同時測定空白玻璃纖維濾膜。其洗脫效率范圍為97.9%～103.8%，相對標準偏差(RSD)為1.1%～1.8%，結果見表2所示。

表2 洗脫效率和批內精密度試驗結果(n=6)Table 2 Elution efficiency and within-run precision(n=6)

2.6 采樣效率

采樣方法的采樣效率通常是指能夠被收集器采集下來的待測物質的量占通過收集器的空氣中待測物質的總量的百分數。采樣效率的高低代表了采樣方法的優劣，通常情況下平均采樣效率在90%以上為宜。采樣效率實驗采用現場采樣法，模擬采樣現場，選擇高、低不同的兩個采樣點，串連兩個濾膜采樣頭，分別以5 L/min流量采集15 min、1 L/min流量采集120 min，按方法處理后進樣[9]。其采樣效率范圍為94.0%～96.2%，結果見表3所示。

表3 采樣效率Table 3 Sampling efficiency

3 結 論

經方法確認，本實驗儀器設備、人員、試劑、環境條件、實測檢出限、測定下限、精密度、準確度等符合GBZ/T 210.4-2008職業衛生標準制定指南 第四部分：工作場所空氣中化學物質測定方法標準要求，可采用該方法進行測定。將本方法應用于某電廠尿素存儲使用場所，測得空氣中尿素濃度為0.12～2.63 mg/m3。通過方法確認及實際應用發現，該方法出峰時間短，峰形好，重現性好，靈敏度高，適合于工作場所空氣中職業性有害因素尿素的檢測工作。