間苯三酚分光光度法測(cè)定燕窩中的海藻酸鈉

李 丹，李國(guó)棟，張亞云

(1 至睿生物(江蘇)有限公司，江蘇 太倉(cāng) 215400；2 蘇州珩悅環(huán)保工程有限公司，江蘇 太倉(cāng) 215400;3 江蘇國(guó)測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，江蘇 昆山 215300)

海藻酸鈉是一種常用的食品添加劑[1-2]，是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產(chǎn)物[3-4]，是一種天然多糖[5-6]。由于其水溶液具有較高的黏度，因此在食品行業(yè)常被用作增稠劑[7]、穩(wěn)定劑[8]、乳化劑等。在燕窩中適量添加海藻酸鈉，可以使燕窩口感柔滑[9]、細(xì)膩，在攪拌時(shí)有粘性[10-11]，并有遲滯感。國(guó)標(biāo)GB 1886.243-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 海藻酸鈉(又名褐藻酸鈉)》中有對(duì)海藻酸鈉的鑒別試驗(yàn)，但僅能對(duì)其定性、不能定量，且所需的試樣溶液濃度較高，而作為添加劑的海藻酸鈉在燕窩中含量較低，檢測(cè)效果不明顯。目前還沒(méi)有關(guān)于海藻酸鈉作為食品添加劑定量測(cè)定其含量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[12]，而余德壽在《海藻酸鈉測(cè)定 分光光度法》一文中提到，海藻酸鈉由β-D甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸按(1→4)鍵連接而成，分子中的醛基物質(zhì)能與間苯三酚反應(yīng)生成黃色絡(luò)合物，其色澤的深淺與海藻酸鈉含量呈正相關(guān)關(guān)系[13]。因此，本文在其研究的基礎(chǔ)上，研究了間苯三酚分光光度法[14]測(cè)定燕窩中海藻酸鈉含量的方法。實(shí)驗(yàn)中探討了與海藻酸鈉反應(yīng)的最佳間苯三酚的加入量，鹽酸加入量的影響[15-16]，酸性條件下海藻酸鈉與間苯三酚的水浴反應(yīng)時(shí)間的確定[17]，顯色后黃色絡(luò)合物的穩(wěn)定時(shí)間[18]，以及黃色絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 儀器

UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；FA 2004電子天平，邦西儀器科技(上海)有限公司。

1.1.2 試劑

間苯三酚(25 g，麥克林)溶液：稱取1.000 g間苯三酚，溶于無(wú)水乙醇，定容至100 mL；海藻酸鈉(25 g，麥克林)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取0.200 g海藻酸鈉，用熱水溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶并定容(使用液：稀釋成0.2 g/L)；鹽酸(500 mL)，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；碳酸鈉(500 g)，南京化學(xué)試劑股份有限公司。

以上試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純，所用水為三級(jí)去離子水。

1.1.3 材料

市售的某品牌燕窩。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 測(cè)定原理

以間苯三酚溶液為顯色劑，海藻酸鈉在酸性條件下，分子中的醛基物質(zhì)與間苯三酚在沸水浴中反應(yīng)生成黃色絡(luò)合物，在440 nm吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出海藻酸鈉的含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取10 支25 mL比色管，依次加入0.00 mL，0.50 mL，0.75 mL，1.00 mL，1.25 mL，1.5 mL，1.75 mL，2.00 mL，2.25 mL，2.50 mL[13]海藻酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別加入10.00 mL鹽酸，混勻后各加入0.70 mL間苯三酚溶液，混勻，置于沸水浴中顯色反應(yīng)65 min，取出后用流水降至室溫，定容至刻度，以空白管為參比，在440 nm處測(cè)定其吸光度。以海藻酸鈉含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品的測(cè)定

移取2.00 mL燕窩試樣于100 mL容量瓶，加入1.000 g固體碳酸鈉[19-20]，在85 ℃水浴條件下加熱3 h，取出冷卻后過(guò)濾。移取1.00 mL濾液于25 mL比色管中，使之按照1.2.2中步驟操作，測(cè)定吸光度。通過(guò)吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出海藻酸鈉含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件確定

2.1.1 吸收波長(zhǎng)

取1.00 mL海藻酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，加10.00 mL鹽酸，混勻后加0.70 mL間苯三酚溶液，混勻，置于沸水浴中顯色反應(yīng) 65 min，取出用流水冷卻后定容，在不同波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。由圖1可以看出，海藻酸鈉的最大吸收波長(zhǎng)為440 nm。

圖1 吸收波長(zhǎng)對(duì)吸光度的影響Fig.1 Effect of absorption wavelength on absorbance

2.1.2 顯色劑用量

分別吸取不同體積的顯色劑，按上述條件進(jìn)行操作并對(duì)海藻酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，研究顯色劑用量對(duì)測(cè)定的海藻酸鈉含量的影響。圖2的結(jié)果表明，隨著顯色劑用量的增加，海藻酸鈉測(cè)定值增大。當(dāng)顯色劑用量增加到0.70 mL以上時(shí)，海藻酸鈉測(cè)定值反而降低，這是因?yàn)檫^(guò)量的顯色劑與反應(yīng)產(chǎn)物繼續(xù)發(fā)生作用，使反應(yīng)過(guò)程逆向進(jìn)行。因此，選用0.70 mL作為顯色劑用量的最佳條件。

圖2 顯色劑用量對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of developer dosage on absorbance

2.1.3 酸性條件(鹽酸加入量)

分別加入不同的鹽酸量按上述條件進(jìn)行操作并對(duì)海藻酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，研究不同酸性條件對(duì)測(cè)定得出的海藻酸鈉含量的影響。由圖3可以看出，隨著鹽酸加入量的增加，海藻酸鈉測(cè)定值不斷增大。當(dāng)鹽酸量增大到10.00 mL以上時(shí)，鹽酸已過(guò)量，測(cè)定出的海藻酸鈉含量出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)榉磻?yīng)溶液中逐漸出現(xiàn)黃棕色沉淀，即選取10.00 mL鹽酸量作為顯色反應(yīng)的最佳酸性條件。

圖3 鹽酸加入量對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid dosage on absorbance

2.1.4 水浴顯色時(shí)間

圖4 水浴時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effect of water bath time on absorbance

分別選取不同的水浴顯色時(shí)間，用秒表計(jì)時(shí)，水浴顯色結(jié)束后立即用流水冷卻，按上述條件進(jìn)行操作并對(duì)海藻酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，分析水浴顯色時(shí)間對(duì)海藻酸鈉的影響。圖4結(jié)果表明，水浴顯色時(shí)間對(duì)海藻酸鈉含量的影響很大。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，測(cè)得的海藻酸鈉含量不斷增大，這是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，顯色反應(yīng)更加徹底。但當(dāng)加熱到65 min之后，測(cè)得的海藻酸鈉含量逐漸降低，這可能是因?yàn)榧訜釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)發(fā)生一些副反應(yīng)導(dǎo)致海藻酸鈉含量降低。由圖4可見(jiàn)，加熱 65 min時(shí)海藻酸鈉測(cè)定值最高，因此最佳條件下的水浴顯色時(shí)間為65 min。

2.1.5 顯色后的放置時(shí)間

按照上述條件，取出用流水冷卻后定容，通過(guò)不同的放置時(shí)間測(cè)定其吸光度，研究放置時(shí)間對(duì)海藻酸鈉含量的影響。由圖5的結(jié)果表明，放置時(shí)間在15 min以內(nèi)時(shí)，測(cè)定的海藻酸鈉含量相對(duì)穩(wěn)定，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，海藻酸鈉的含量不斷增加，表明放置15 min之后，海藻酸鈉的含量不再穩(wěn)定。因此顯色反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)立即比色，且比色時(shí)間以不超過(guò)15 min為宜。

圖5 顯色后放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.5 Effect of storage time on absorbance after color development

2.2 工作曲線與檢出限

方法線性方程為y=3.4609x+0.0148，r2=0.9996；線性范圍為0～0.5 mg。根據(jù)6次最低濃度點(diǎn)(0.1 mg)的測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)差(S)，以3S計(jì)算求得方法的檢出限為0.03 mg/mL。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別配制海藻酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量為0.15 mg，0.30 mg，0.45 mg，重復(fù)測(cè)定6次。精密度測(cè)定結(jié)果如表1所示，海藻酸鈉的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.58%～3.78%之間，可滿足海藻酸鈉測(cè)定試驗(yàn)的要求。

表1 海藻酸鈉精密度的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of precision of sodium alginate

2.4 樣品的加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別移取燕窩試樣(燕窩1含有海藻酸鈉、燕窩2不含海藻酸鈉)2.00 mL于100 mL容量瓶，每個(gè)樣品6份，加入海藻酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液0.5 mL、1.25 mL、2.25 mL(每種濃度2個(gè))，其余步驟同1.2.3；由6個(gè)測(cè)定結(jié)果計(jì)算得出燕窩中海藻酸鈉的含量，同時(shí)計(jì)算回收率，并得出6個(gè)回收率的平均值和RSD。結(jié)果顯示：燕窩1的海藻酸鈉加標(biāo)回收率范圍在90.0%～104.0%，均值為96.2%，RSD為5.5%；燕窩2的海藻酸鈉加標(biāo)回收率范圍在85.0%～97.8%，均值為92.7%，RSD為4.8%。

表2 海藻酸鈉含量及加標(biāo)回收率的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of sodium alginate content and standard addition recovery

3 結(jié) 論

王澤文等在《褐藻酸鈉的分光光度法測(cè)試技術(shù)》中研究了采用銅試劑顯色分光光度法測(cè)定褐藻酸鈉的含量，該方法通過(guò)間接法測(cè)定，涉及試劑種類多，操作復(fù)雜。尚德榮等在《海帶中褐藻膠含量測(cè)定方法的建立》中研究了質(zhì)量法和醋酸鈣法測(cè)定海帶中褐藻膠的含量，該法存在操作時(shí)間長(zhǎng)、步驟多、雜質(zhì)干擾等問(wèn)題。

而本文研究了間苯三酚分光光度法測(cè)定燕窩中海藻酸鈉含量的方法，該法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、精密度好等優(yōu)點(diǎn)，為研究燕窩中海藻酸鈉的測(cè)定提供了可靠的技術(shù)方法，適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、工廠中產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)測(cè)、海藻酸鈉降解監(jiān)測(cè)等實(shí)際工作，具有推廣價(jià)值[21]。