磁性分子印跡技術在藥物分析學創新實驗中的應用*

陳振羽，郭亞甜，張儀恒，張宇欣，張育珍，2，秦 蓓，2，張 博，2

(1 西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021；2 西安醫學院藥物研究所，陜西 西安 710021)

左氧氟沙星(Levofloxacin，Lev)是一種喹諾酮類抗菌素，具有抑菌范圍廣，抗菌活性強的優點，在呼吸道、胃腸道、泌尿生殖系統、皮膚軟組織等感染方面有良好療效[1-2]。隨著我國畜牧業的發展，該藥品被廣泛的應用在動物飼養中，用以預防和治療相關感染，然而該藥物通過代謝傳遞，會殘留于各種奶制品中，由于嬰幼兒常年食用配方奶粉，導致左氧氟沙星轉入小孩體內，產生惡心、腹瀉、頭暈失眠、皮膚過敏、尤其是骨骼發育等諸多不良反應，對嬰幼兒健康造成不可忽視的潛在威脅，但是，傳統的檢測技術如熒光光譜法、色譜分析法，紫外光譜法等還存在樣品前處理繁瑣、靈敏度低、選擇性差等原因，迫切建立一種簡便而且能夠高效識別檢測嬰幼兒配方奶粉中左氧氟沙星的定量方法[3-5]。

磁性表面分子印跡技術(Magnetic Surface Molecularly Imprinted Technique，MSMIT)，是以固相基質為載體并在其表面進行聚合反應，以生命科學理論中酶與底物間的“鎖-鑰原理”為模型，合成與模板分子在空間結構和功能基團排布上高度吻合的三維空穴，并賦予磁性分離響應而建立起的一種特異性分離檢測技術。該方法克服了傳統分子印跡聚合物對模板分子包埋過深、傳質速率慢、分離效率低等缺點，通過三維空穴的“記憶效應”，可以很好的識別復雜體系中的模板分子，通過外加磁場快速分離，高效地開展對復雜體系中目標分子的分離檢測工作，具有選擇性高、穩定性強、干擾小、重復性好等諸多優點[6-7]。

本次研究型創新綜合實驗規劃：(1)查閱文獻，了解磁性表面分子印跡技術的選擇性吸附機理；(2)拓展知識，了解國內外動態，論述本項目意義；(3)設計并討論實驗方案；(4)開展材料合成、表征以及吸附分離工作；(5)Origin作圖以及數據分析[8-11]。

本次研究型創新綜合實驗內容：采用熱溶劑法制備Fe3O4納米磁球[12-14]，包裹硅膠并引入雙鍵，以此為載體材料，左氧氟沙星為模板分子，衣康酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，2，2-偶氮二異丁腈為引發劑，制備對左氧氟沙星具有特異性吸附的磁性表面分子印跡聚合物，利用該磁性聚合物對奶粉樣品中左氧氟沙星進行分離富集，開發一種新的磁性印跡分離材料。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

SQP電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；T09-1S恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司；CMD-20X智能型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；SB—5200 DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DZF-6020真空干燥箱，上?，槴\實驗設備有限公司；TS-211B氣浴搖床，上海島析實業有限公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀，北京布魯克科技有限公司；Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；SHZ-D循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司。

左氧氟沙星(Levofloxacin，簡寫Lev，99%)，武漢拉那白醫藥化工有限公司；三氯化鐵 天津市盛奧化學試劑有限公司；無水乙酸鈉、檸檬酸三鈉、α-甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AM)，天津市科密歐化學試劑有限公司；2，2-偶氮二異丁腈(AIBN，98%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，99%)、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS，97%)、衣康酸(IA，99%)、甲基丙烯酰胺(98%)、4-乙烯基吡啶(4-VP，96%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、戊二醛(GA)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAAm)、乙腈、冰乙酸、正硅酸乙酯(TEOS)，天津市河東區紅巖試劑廠；實驗用水為去離子水。

1.2 磁性表面分子印跡聚合物的制備

1.2.1 Fe3O4的制備

稱量1.35 g FeCl3·6H2O于平底燒瓶中，加入40 mL乙二醇，磁力攪拌使之溶解變為橙黃色液體；然后加入3.1 g無水乙酸鈉，繼續攪拌至深黃色；再稱取0.4 g檸檬酸三鈉于平底燒瓶中，攪拌30 min；將溶液轉入聚四氟乙烯水熱反應釜中，在烘箱中200 ℃下反應8 h。待反應結束后，取出反應釜并冷卻至室溫，棄去上清液，將制成的黑色沉淀轉移到燒杯里，用去離子水和甲醇交替洗滌三次，磁性分離，在50 ℃真空減壓干燥4 h以上即得Fe3O4納米磁球。

1.2.2 Fe3O4@SiO2的制備

稱取上述Fe3O4納米磁球400 mg分散于160 mL無水乙醇和40 mL去離子水的混合溶液中，超聲30 min，直至觀察不到聚集現象，然后加入4 mL NH3·H2O使溶液呈堿性，再緩慢逐滴滴加3 mL TEOS，繼續超聲聚合反應1 h，中途搖晃瓶身防止底部聚沉。將得到的產物進行磁性分離，用去離子水和甲醇交替洗滌三次，在50 ℃真空減壓干燥4 h以上即得Fe3O4@SiO2納米磁球。

1.2.3 Fe3O4@SiO2@MPS的制備

稱量200 mg的Fe3O4@SiO2納米磁球于儲液瓶中，加入80 mL乙醇和80 mL水并超聲30 min，再加入0.5 mL的MPS繼續超聲并緩慢滴加2.0 mL氨水，置于搖床中，在60 ℃、150 rpm下振蕩反應7 h。待反應結束后，進行磁性分離，將制得的磁性納米粒子用去離子水和甲醇交替洗滌三次，在50 ℃真空減壓干燥4 h以上即得Fe3O4@SiO2@MPS納米磁球。

1.2.4 Lev-MMIPs與MNIPs的制備

稱取0.1 mmol的左氧氟沙星于平底燒瓶中，加入50 mL的甲醇使其溶解，然后加入0.4 mmol衣康酸，室溫下預聚合2 h；隨后加入50 mg用甲醇超聲分散均勻的Fe3O4@SiO2@MPS納米磁球，放入搖床中，在30 ℃、150 rpm振蕩組裝1 h；再加入1 mmol交聯劑EGDMA和20 mg引發劑AIBN，在N2保護下于搖床中60 ℃、150 rpm聚合反應20 h。反應結束后，將合成的印跡材料進行磁性分離，用甲醇和去離子水交替洗滌三次，在50 ℃真空減壓干燥1 h。然后用200 mL甲醇：冰乙酸(8:2，V/V)溶液索氏提取洗脫24 h洗脫除去模板分子。最后，用甲醇合成材料洗至無酸味，60 ℃下真空減壓干燥即得磁性表面分子印跡聚合物，簡寫Lev-MMIPs。

在不加入模板分子的情況下，重復以上實驗步驟制備對照聚合物MNIPs。

1.3 奶制樣品的前處理及應用

稱取2 g嬰幼兒配方奶粉于20 mL溫水中超聲溶解，精確吸取5 mL溶液于25 mL容量瓶中，再加入一定體積的左氧氟沙星儲備液，用甲醇定容到刻度線，混勻后倒入離心管，渦旋混勻30 s，于8000 rpm離心15 min，取上清液即得處理好的奶制樣品。

1.4 高效液相色譜(HPLC)分析

色譜條件：Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀； Agilent HC-C18(4.6×150 mm，5 μm)色譜柱；流動相：水相為0.1%甲酸水溶液(A)，有機相為10%乙腈甲醇溶液(B)，梯度洗脫 (0～2.00 min，A:B=80%:20%；2.01～4.00 min，A:B=70%:30%；4.00～10.00 min，A:B=50%:50%；10.01～12.00 min，A:B=80%:20%)；流速0.8 mL/min；檢測波長294 nm；柱溫為30 ℃；進樣量5 μL。

移取3 mL加標樣品于5 mL離心管中，加入10 mg磁性印跡材料，震蕩吸附1 h，然后磁性分離，用1 mL洗脫液(10%冰乙酸甲醇溶液)洗脫30 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜儀分析。

2 結果與討論

2.1 磁性印跡聚合物的制備

2.1.1 功能單體的考察

Lev-MMIPs的吸附能力依賴于許多不同的因素，其中功能單體通過氫鍵與模板分子作用，在立體空間中，不同功能單體與模板分子作用強弱不同，表現出吸附容量的差異，同時由于三維結構的構型，也表現出選擇性的大小，兩者共同影響印跡材料對模板分子的選擇性和吸附容量，是合成材料的關鍵因素。在考察功能單體的過程中，加入左氧氟沙星0.1 mmol，交聯劑1 mmol，引發劑20 mg，選擇丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)、衣康酸(IA)、甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMA)、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAM)共7種功能單體制備相應的磁性印跡聚合物，以吸附容量Q作為指標，評價Lev-MMIPs對Lev的特異性吸附能力，見表1所示。

表1 功能單體的考察Table 1 Investigation of functional monomers

實驗結果顯示，在相同其它實驗條件下，衣康酸作為功能單體吸附容量最大，可以說明當衣康酸作為功能單體時，對左氧氟沙星的選擇性吸附最好，所以本文選擇其作為制備磁性表面分子印跡聚合物的最佳功能單體。

2.1.2 致孔劑的考察

反應溶劑也稱為致孔劑，在反應體系中，溶解模板分子、功能單體、交聯劑等，同時分散Fe3O4@SiO2@MPS納米磁球，合適的致孔劑可以很好的促進表面聚合反應，有利于三維空穴的形成，影響Lev-MMIPs的吸附容量，所以研究中選擇7種溶劑:甲醇、甲醇:水(1:1，V/V)、乙腈、乙腈:水(1:1，V/V)、DMF、DMF:水(1:1，V/V)、甲醇:乙腈(1:1，V/V)制備Lev-MMIPs磁性印跡材料，以吸附容量Q作為指標，評價Lev-MMIPs對Lev的吸附效果，見表2所示。

表2 致孔劑的考察Table 2 Investigation of pore forming agent

實驗結果表明，在相同其它條件下，以甲醇作為致孔劑制備的Lev-MMIPs對Lev具有最優的吸附容量。因此本文選擇甲醇作為合適的致孔劑。

2.1.3 交聯劑的考察

交聯劑在印跡聚合物膜的形成過程中有著支撐骨架效應，交聯劑過多使得聚合反應速率過快，導致材料成絮狀，過于蓬松，使得聚合物嚴重團聚，同時磁性消失；交聯劑過少使得聚合反應不完全，印跡聚合物膜不易形成，同時形成空穴過少，吸附容量過低，因此交聯劑在磁性表面分子印跡聚合物的合成過程中起著關鍵作用。在本研究中，固定模板分子和功能單體的用量，分別加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAAm)、戊二醛(GA)3種交聯劑各1 mmol制備相應的磁性印跡聚合物，以吸附容量Q作為指標，評價Lev-MMIPs對Lev的吸附性能，實驗結果表明，當模板分子:功能單體:交聯劑=1:4:10時，選擇性吸附最好，所以后續采用該優化比例制備吸附材料用于實驗研究，見表3所示。

表3 交聯劑的考察Table 3 Investigation of crosslinking agent

2.2 磁性印跡聚合物的表征

2.2.1 TEM表征分析

通過表面聚合反應，在最優比例條件下制備出磁性表面分子印跡聚合物，該材料呈球形，單分散性良好，具有清晰的核-殼結構，內部黑色部分為磁性Fe3O4核，約160 nm，外部為聚合物層，整體粒徑約200 nm，印跡層位于外表面，吸附過程中傳質速率快，可有效減少“包埋”現象，提高選擇性吸附容量，見圖1所示。

圖1 Lev-MMIPs透射電鏡圖Fig.1 The TEM image of Lev-MMIPs

2.2.2 紅外光譜分析

對Fe3O4、Fe3O4@SiO2、MMIPs進行紅外光譜表征。由裸磁球Fe3O4的紅外光譜曲線(圖2a)可以看出，586 cm-1附近出現的特征峰歸屬于Fe-O的伸縮振動，說明Fe3O4制備成功；在Fe3O4@SiO2的吸收曲線(圖2b)中出現1110 cm-1的特征峰，是典型的Si-O-Si伸縮振動吸收峰，結合TEM圖可以證明二氧化硅層很好的包裹于Fe3O4的外側；在印跡材料的紅外光譜曲線(圖2c)中，可以看到1730 cm-1出現很明顯的特征吸收峰，該峰歸屬于交聯劑和功能單體中的C=O，而1400 cm-1附近的特征峰則是印跡層中大量C-O伸縮振動所致，3131 cm-1處的寬吸收峰，則歸屬于衣康酸羧基中的-OH。三者光譜圖分析對比可以看出，通過聚合反應，成功地合成了磁性表面分子印跡聚合物，見圖2所示。

圖2 紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra

2.3 磁性印跡聚合物對左氧氟沙星的分離富集

為了驗證合成印跡材料對實際樣品中左氧氟沙星的選擇性吸附效果，研究中分別配制嬰幼兒配方奶粉空白溶液、以及加標模擬樣品溶液，采用1.4方法分離富集并進行色譜分析，見圖3實驗結果顯示，圖3a為空白樣品圖，其中雜質多而且基線噪音大；圖3b為加標樣品，出現了左氧氟沙星色譜峰，空白處幾乎無干擾；圖3c為采用合成的磁性印跡材料吸附，然后洗脫富集所得結果。由此可以看出，背景噪音降低、樣本雜質基本都被剔除，左氧氟沙星信號明顯提高，可以說明合成的磁性表面分子印跡聚合物對奶粉樣品中的左氧氟沙星有很好地分離富集效果。

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 Chromatograms of HPLC

2.4 研究型綜合實驗運行模式探討

2.4.1 文獻查閱與批閱

藥學本科生中大學生創新創業項目的開展，對在校大學生培育創新創業項目有很好地支撐效果，也對大學生日后的科學研究興趣和研究思維具有很好地啟蒙作用，同時也反哺理論教學，使學生對本專業知識以及學科前沿有更高層次理解，激發學生興趣，調動學生創新創業潛能。為了使學生很好地認識項目，結合本科生時間有限的特點，建立QQ討論群，安排每名學生每周查閱文獻兩篇，研讀并做好讀書筆記，然后上傳QQ群，項目組學生共享，指導老師對每篇文獻進行批閱，用來指導學生，掌握學生看文獻的領域是否正確，內容是否相關，有沒有可借鑒之處，創新點是什么等幫助學生、扶持學生走向正軌。

2.4.2 運用PBL教學法指導開展實驗

以問題為導向的教學方法(problem-based learning，PBL)，是基于現實世界的以學生為中心的教育方式[15-16]。該方法通常被用于教學的過程中，而在本項目的執行過程中，我們采用該方法，收集實驗環節中的各種問題，然后集中討論，達成共識，再去落實實驗研究，很好地推動了學生實驗研究的開展。本項目研究過程中，共有合成、表征、分離富集三個方面，共收集10問題加以討論，比如：“功能單體有哪些”、“ 吸附的作用力是什么”、“表征材料的方法有哪些”、“氮氣保護的操作如何實現”等，很好的從操作和理論兩方面給學生充分的指導，保證學生順利完成項目內容。

2.4.3 作圖、數據處理和結果分析

作圖、數據處理以及每一步結果分析，對學生和后續實驗都很重要。在大創項目落實的過程中，我們對Origin、ChemDraw、3DMax、Excel等軟件進行了集中培訓，提供一些數據學生練習，老師指導，手把手教會學生如何作圖、制表、處理數據等。在項目期間，要求學生一邊做實驗，一邊通過作圖形象地表達研究內容，及時進行數據分析實驗結果，這樣不僅僅很好地完成了實驗內容，而且提高了學生繪圖、分析數據的能力，很好地完成了項目內容。

3 結 論

磁性表面分子印跡聚合物在樣品分離富集過程中特異性強，檢測濃度低，能有效地改善樣品中痕量分析的諸多不足。本文以雙鍵修飾后的Fe3O4@SiO2作為支撐材料，左氧氟沙星為模板分子，衣康酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，2，2-偶氮二異丁腈為引發劑，甲醇為致孔劑合成制備了Lev-MMIPs磁分子印跡材料，并對嬰幼兒配方奶粉中加標左氧氟沙星開展了分離富集效果驗證。通過研究型創新綜合實驗的開展，促進學生掌握磁性印記聚合物的制備、原理、表征、吸附性能研究等，培養學生查閱文獻解決問題、規范儀器操作、培育創新思維、開拓研究領域眼界等，提高學生繪圖、制表、分析數據等水平，提高藥學本科生的科研綜合能力，落實大學生創新創業項目開展。