天然藥物化學課程系統預實驗的探索與實踐*

李艷平，蔡 鋒，何紅平

(云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500)

天然藥物化學是中醫藥院校藥學類、制藥工程、藥物制劑類專業核心課之一，這是一門實踐性非常強的課程，通過理論知識和實踐技能的融合，培養具備從事天然藥物生產和研發相關能力的學生。天然藥物化學實驗課程的設計主要包括天然藥物開發過程中的樣品的提取、分離純化、性質檢識和結構鑒定[1]。各本專科院校在天然藥物化學實驗課上常開設的實驗主要是傳統經典一些提取分離實驗，主要包括：大黃中蒽醌類成分的提取及應用pH梯度萃取法對其分離純化，槐米中蘆丁的提取、純化、水解和檢識，鹽酸小檗堿的提取分離檢識、薯蕷皂苷元的提取分離和鑒定等，采用到的實驗方法也主要是常規的煎煮法、回流提取法、超聲提取法、結晶以及重結晶操作等[2]。近年來，隨著藥學學科的快速發展，國家也越來越重視中醫藥現代化，天然藥物以原料藥和提取物的形式出口額度也逐年增加，國家對具備天然藥物提取分離技術的人才的需求也大量提升[3]。加之現代社會更加鼓勵和提倡對藥學專業領域研究內容的創新，傳統單一的實驗內容和操作難以滿足綜合應用型天然藥物研發人才的培養要求，這就需要從藥學專業的深度、系統性、綜合性以及創新性方面來對天然藥物化學實驗進行改革和更新[4]。

天然來源的藥物中所含的化學成分比較復雜，在研究其化學成分之前，一般應先進行預試驗，初步了解其中可能含有哪些類型的成分，以便對提取、分離工作提供有益的參考，預試驗一般可分為兩大類：一類是單項預試驗，即可根據需要，重點檢查某類化學成分的存在與否[5]，這也是大多數天然藥物化學實驗所涉及的。另一類是系統預試驗，首先根據天然藥物中所含各類化學成分在不同極性的溶劑中的溶解度不同，利用相似相溶原理，用不同極性的溶劑將其提取出來，分為極性不同的幾個部分，再用各類成分的定性反應(包括沉淀和顯色反應等)及層析法(薄層色譜、紙色譜等)檢查，最后綜合分析判斷各類成分的有無或存在的可能性。這就要求學生在做天然藥物化學成分預實驗前，首先須熟悉天然藥物化學成分各主要結構類型的性質、檢識反應，能對試驗結果進行綜合初步判斷。對學生的綜合應用能力、綜合操作能力、實驗過程中分析解決問題的能力均能得到更好的培養。本文將以實例形式對我校實際開設的天然藥物化學系統預實驗實驗設計、學生操作、考核評價以及學生能力培養等方面進行探索和總結。

1 實驗設計

1.1 實驗藥材樣本的選擇

在實驗的樣本選擇方面，我們除了選擇一些富含各類化學成分的經典中藥之外，還專門的選擇了一些云南特有的天然藥物，以便學生在完成實驗之后，通過文獻檢索，了解更多我們身邊的特色天然藥物。為了增加實驗的深度和系統性，我們將2～3種粉碎的藥物混合在一起(見表1)，使得學生在成分檢測的過程中有更多的陽性結果，充分的綜合分析試驗。

表1 天然藥物化學系統預實驗藥材樣本設計表Table 1 Design of medicinal materials in system preliminary experiments of natural medical chemistry

1.2 實驗分組

以48人的班級為例，我們設置每3個人為一組，準備16份混合藥材樣品，每組同學可以隨機抽取一個藥材樣品編號，保證每組的樣品不重復，而每組藥材的組成也不同，這樣可以避免了同學之間相互的借鑒抄襲，還能培養學生獨立思考獨立操作的能力。

1.3 實驗方法

1.3.1 預試驗溶液的制備

用室溫浸泡過夜的方法制備冷水浸液，用來檢查檢查氫基酸、多肽和蛋白質。

藥材樣品于水浴上60 ℃左右熱浸半小時，趁熱過濾制得熱水提取液，用于供檢查糖、多糖、有機酸、皂苷、苷類、酚類、鞣質等成分用。

95%乙醇水浴上加熱回流一小時，稍冷后加入蒸餾水使其含醇量為70%，濾液在分液漏斗中用石油醚(60～90 ℃)分兩次萃取除去葉綠素等，分出下層乙醇提取液，濃縮至小體積后檢查黃酮、蒽醌、香豆素、萜類、甾體化合物、內酯類化合物、強心苷、有機酸、酚類、鞣質等成分。

0.5%硫酸的乙醇溶液于水浴上加熱回流制備酸性乙醇提取液用來檢查生物堿。

用石油醚(60～90 ℃)室溫浸泡提取2～3 h，過濾得石油醚提取液，用來檢查脂溶性的揮發油、萜類和甾體化合物。

1.3.2 各類成分的檢查

檢查生物堿類成分取酸性乙醇提取液先用稀氨水調至中性，于水浴上蒸干，殘渣加5%硫酸溶解過濾，濾液用碘化鉍鉀試驗、碘化汞鉀試驗、硅鎢酸試驗，觀察沉淀的產生及顏色。

檢查水溶性成分如氨基酸、多肽和蛋白質類時所用到的實驗有加熱沉淀試驗、雙縮脲試驗、茚三酮試驗以及吲哚醌試驗，觀察沉淀的產生及顏色變化。

檢查還原糖、多糖和苷類化合物時所用到的實驗有菲林反應、α-萘酚試驗、還原性多糖的試驗等，記錄觀察沉淀的產生及顏色變化。

檢查皂苷類時所用到的實驗有泡沫試驗、醋酐-濃硫酸反應、溶血試驗，觀察并記錄現象。

檢查有機酸類成分時所用到的實驗有pH試紙試驗、溴酚藍試驗、溴甲酚綠試驗。

檢查酚類化合物和鞣質類成分時所用到的實驗包括三氯化鐵試驗、三氯化鐵—鐵氰化鉀反應、香草醛—鹽酸反應和明膠試驗，觀察并記錄現象。

檢查甾體及三萜類化合物所用到的實驗有醋酐-濃硫酸反應、氯仿-濃硫酸反應、三氯醋酸反應等。

檢查黃酮類化合物所用到的實驗包括鹽酸-鎂粉反應、三氯化鋁反應、醋酸鎂反應、氨熏試驗等。

檢查內酯、香豆素及其苷類所用到的實驗為熒光試驗、重氮化反應、異羥肟酸鐵反應。

檢查強心苷類所用到的實驗為3，5一二硝基苯甲酸反應(Kedde反應)、堿性苦味酸反應(Baljet反應)、亞硝酰鐵氰化鈉反應(Legal反應)。

檢查蒽醌類所用到的實驗為堿液試驗、醋酸鎂反應和硼酸溶液試驗。

檢查揮發油、油脂類所用到的實驗為油斑試驗、磷鉬酸試驗、香草醛-硫酸試驗。

1.3.3 各類成分的層析檢查

天然藥物化學成分的預試驗除用上述的定性反應外，還可需要用層析法進行進一步的檢查和確認，展析結果容易判斷，可減少成分間的相互干擾。還可以根據層析種類、條件、展開劑組成以及色斑的比移值(Rf值)初步判斷樣品中所含化學成分的溶解性能和極性大小，也可以通過與標準樣品對照，初步判斷樣品中所含化合物種類。此外，我們也會提前給同學們提供一些各類化學成分的參考層析條件供參考。例如生物堿類：(1)氧化鋁層析(中性、堿性)展開劑：氯仿-甲醇(9:1)或苯-甲醇(8:2)顯色劑可用改良碘化鉍鉀試劑；(2)硅膠薄層色譜展開劑(常含堿性溶劑以防止脫尾)：石油醚-二乙胺(9:1)、氯仿-丙酮-二乙胺(5:4:1)或氯仿-甲醇-二乙胺(7:3:0.2)，顯色劑：改良碘化鉍鉀試劑。

1.3.4 系統預實驗結果要求

要求每組學生協同合作對以上的實驗內容進行提取、萃取、過濾、成分檢識、層析檢識實驗，綜合分析試驗結果，得到實驗結論，結論中要求明確所選擇的藥材樣品中一定含有的兩類成分、可能含有的成分、不含的成分。并通過薄層色譜檢識一定含有的成分，計算比移值(Rf值)。最后，根據實驗老師提供的藥材組成通過查閱文獻，總結反思在系統預實驗過程中的經驗和教訓，并根據檢索到的文獻和自己實驗的結果設計樣品中其中一味藥材中主要成分的提取、富集、分離的方法，完成實驗報告的撰寫。

2 學生操作

以藥材N包含槐米和黃連的混合藥材為例，槐米是豆科植物槐干燥的花蕾，是一種天然抗氧化劑，其中主要含黃酮、皂苷、甾醇等成分。以黃酮類成分蘆丁為主，此外還含有其它多種化學成分包括槲皮素、染料木素、異鼠李素等[6]。而毛茛科黃連屬植物黃連中富含小檗堿、黃連堿、掌葉防己堿等生物堿，可用于治急性結膜炎、急性細菌性痢疾、急性腸胃炎等癥[7]。因此這兩者的混合得到的藥材N主要檢測的目標是黃酮和生物堿類成分。在學生并不知道藥材組成的情況下，同學們通過對N藥材的水提液、95%乙醇提取液、酸性乙醇提取液以及石油醚提取液的檢查，得到結果見圖1。

圖1 實驗結果展示Fig.1 Display of experimental results

學生通過多種提取方法、較為全面的各類化合物的檢查，自己設計并記錄實驗結果的表格，將試驗結果及清楚明了的記錄結果的圖片彩打并粘貼于實驗報告上，在數據分析時清晰準確，結論簡潔明了。

3 考核評價

天然藥物化學系統預實驗的考核和效果評價包括4個方面：(1)自學能力評價，包括預習報告， 相關資料查閱， 相關操作方法熟悉程度。(2)實驗操作評分， 實驗老師在學生實驗過程中觀察學生基本操作、儀器使用、動作的規范性和熟練程度熟練制定A(優)、B(良)、C(合格)、D(不合格)四個等級。(3)實驗過程中學生團隊合作以及分析解決問題的情況評分。(4)根據實驗的原始記錄、實驗報告、實驗結果分析、及查閱文獻設計的實驗流程圖正確性、完善性進行評分。(5)學生通過完成實驗的自我評價。綜合以上五個方面，得到最終的實驗成績。這種綜合評分， 能從實踐技能掌握到主觀能動性提升以及開拓創新能力培養方面反映了以素質教育為主導的學生對實驗掌握的真實情況。

4 學生能力培養

在天然藥物化學實驗課教學的實施過程中，系統預實驗會放在實驗課程的最后一次，同時也作為一種實驗考核，老師在第一次實驗課開始時就告知學生系統預實驗的整體構思和目的意義，提前給學生較長的時間來學習各種實驗方法，做好操作技能和思想上的準備，這一階段可以從思想是上加強學生對必須實驗技術的掌握，培養學生自學能力、認真思考和創造性思維的訓練能力。在系統預實驗執行的過程中，老師只提供相應的提綱性的實驗方法和檢查項目，并不是讓學生按照既定的步驟操作，因此需要學生提前制訂好提取方法，檢查所需要的溶劑試劑及具體操作步驟，除了可以鞏固學生對學過的理論知識、實驗原理的理解，還可以培養學生興趣，訓練的科研素質。操作過程中還能培養學生的團隊合作意識，利用團隊知識來分析解決問題的能力和動手操作能力。最后，在實驗報告的分析撰寫階段，由于系統預實驗的結果數據量大，可以鍛煉學生對整個數據整理分析凝練總結的能力，以及針對結果的文獻檢索和舉一反三的能力[8]。

5 存在的問題

開設天然藥物化學系統預實驗的開始內容需考慮到實驗室的配置，包括儀器的配備，試劑的使用，實驗室安全等。由于實驗過程中所涉及的提取方法同時涉及到天然藥物化學中的多個提取方法，并且可能需要同時開展，這對實驗室儀器設備的準備管理會造成一定的壓力。此外，大量的溶劑試劑的使用，對學生實驗技能要求較高，如果學生有些基本操作不過關，還可能造成一定的安全隱患。這樣的系統預實驗類似半開放式實驗，也需要比平時多的實驗指導老師實時指導學生，否則難以發現學生在實驗操作或者突發問題解決方面的不足。同時，對于理論和實踐知識掌握均較為扎實也善于融會貫通的學生，這是激發興趣提升能力很好的鍛煉機會，然而對于基礎較為薄弱操作能力欠缺的學生而言可能較為困難，容易引發學生的畏難情緒，使得這種培養模式的效果大打折扣。

6 結 語

以這種類似半開放式實驗教學的形式開展天然藥物化學的系統預實驗，不同于以往以教師為重心， 講解實驗原理、給出實驗具體步驟，學生按部就班操作，無法很好地反饋提升的形式，強調了學生主體的作用。教師由單一的“教”轉變于“引導”， 培養了學生分析解決問題的能力， 鍛煉了學生們自學能力、獨立思考及獨立操作的能力， 為學生創造性思維的發揮以及實施提供了平臺， 符合現代藥學教育改革的需要，對藥學類本科實踐教學具有重要意義。