QuEChERS/氣相色譜-串聯質譜-內標前置法測定茶葉中37種農藥殘留

黃 微，馬玉鳳，孟怡璠，李崇勇*，李春梅，李 婷，王俁心，丁 偉

（1.陜西省茶葉產品質量監督檢驗中心 漢中市食品藥品監督檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000；2.城固縣食品藥品檢驗檢測中心，陜西 漢中 723200）

我國是茶葉主要生產國，也是茶文化的起源國。茶葉因具有獨特的風味和保健功能而深受大眾喜愛［1］。影響茶葉質量安全的指標主要有農藥、真菌毒素、重金屬殘留等［2］，其中農藥殘留是最被人們關注的指標之一。茶葉產生農殘的原因一方面在于農藥的不規范使用，如茶園使用違禁農藥、超量噴灑農藥、忽視施藥安全間隔期等；另一方面在于茶葉種植過程受到外界污染，如土壤、大氣、水體中殘存的農藥向茶葉轉移［3］。過高的農藥殘留嚴重影響茶葉的質量安全，世界多國對茶葉中農藥的最大殘留限量（MRL）均做了嚴格規定。我國2021 年發布的GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》標準［4］中涉及茶葉農藥殘留的指標有106 項，較2019 版增加了41 項，且降低了部分農藥的MRL 數值。限量標準不斷從嚴，體現出我國對茶葉質量安全日益嚴格的要求。

茶葉中農藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）［5］、氣相色譜-質譜法（GC-MS）［6］、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）［7］、液相色譜法（LC）［8］、液相色譜-質譜法（LC-MS）［9］、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）［10］等。由于茶葉成分復雜，基質對目標組分干擾嚴重，采用GC、LC 可能導致假陽性。GC-MS、LC-MS 雖能準確定性和定量，但與三重四極桿串聯質譜相比，其抗干擾能力和靈敏度不夠理想。GC-MS/MS和LC-MS/MS具有抗干擾能力強、靈敏度高、準確度高等特點，近年來被普遍應用于茶葉中農殘的檢測［11］。

常用的茶葉前處理方法主要有振蕩提取［6，12］、渦旋提取［9］、超聲提取［5，7-8］、加速溶劑萃取［10，13］、固相萃取［10，13］、分散固相萃取［6-7］、固相微萃取［14］、凝膠滲透色譜［7，15］等。QuEChERS法是在分散固相萃取技術基礎上發展的一種新型前處理方法，具有快速簡單、經濟高效、可靠安全等優點，在茶葉農殘檢測 領 域 得 到 廣 泛 應 用［5，8，16-17］。國 家 標 準GB 23200.113-2018［12］、GB 23200.121-2021［18］均 以QuEChERS 法作為前處理方法。為降低分析方法的誤差，用QuEChERS 法進行前處理時常采用內標法進行定量。內標法可分為內標前置和內標后置兩種方式，內標前置即在樣品前處理前加入內標（ISTD），內標后置即在樣品前處理后加入內標。傳統的內標法選擇與目標化合物性質相近的化合物作為內標，一般采用內標后置方式（如GB 23200.113-2018［12］），能夠校正信號變化和儀器不穩定性帶來的誤差，但無法補償前處理過程造成的待測物損失。同位素內標法選擇經同位素標記的化合物作為內標，一般采用內標前置方式［19］，能夠較好地消除前處理過程和儀器不穩定性帶來的誤差，但由于同位素內標物價格昂貴且不易獲得，其在茶葉中農藥多殘留檢測中的應用受限。本文擬采用QuEChERS 結合GC-MS/MS 對茶葉中具有代表性的37 種農藥殘留進行檢測（包括14 種有機磷類、10 種有機氯類、8 種擬除蟲菊酯類和5 種有機雜環類），以內標前置法加入環氧七氯內標并進行定量，以校正前處理過程中的目標物損失以及儀器測定過程產生的誤差，從而建立一種操作簡單、快速高效、回收率高、成本低的茶葉中農藥殘留檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

GCMS-TQ8040 氣相色譜-三重四極桿質譜儀、SH-RXi-5Sil MS 石英毛細管色譜柱（日本Shimadzu公司）；IKA VORTEX2渦旋混勻器（德國IKA公司）；MFV-24智能氮吹儀（廣州得泰儀器科技有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；MS1003S電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

37種農藥標準品和內標環氧七氯（農業部環境保護科研監測所，質量濃度均為100 mg/L）；乙腈（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國Mreda公司）；正己烷、丙酮（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）；QuEChERS 萃取鹽包（含6 g 硫酸鎂、1.5 g 乙酸鈉）、QuEChERS 萃取凈化管（含1200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18、400 mg GCB）（月旭科技（上海）股份有限公司）；綠茶、紅茶為日常送檢樣品，白茶、黑茶購于本地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制混合標準工作溶液：分別移取37 種農藥標準品（100 mg/L）各1 mL 于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成2 mg/L 的混合標準溶液。取適量混合標準溶液用乙酸乙酯逐級配制成質量濃度分別為0.2、1、2、10、20、100、200、400、800μg/L的系列混合標準工作溶液。

內標溶液：取1 mL 環氧七氯（100 mg/L）于20 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成5 mg/L的內標溶液。

基質混合標準工作溶液：將空白基質溶液氮氣吹干，加入20μL 內標溶液，以1 mL 混合標準工作溶液復溶，過0.22μm有機相微孔濾膜，得到相應質量濃度的基質混合標準工作溶液。

1.2.2 QuEChERS 前處理內標前置法：準確稱取2 g（精確至0.001 g）粉碎均勻的茶葉樣品置于50 mL 塑料離心管中，加入200 μL 內標溶液和10 mL 水混勻，浸泡30 min。加入20 mL 乙腈，渦旋1 min，超聲提取20 min，加入QuEChERS 萃取鹽包（含6 g 硫酸鎂、1.5 g 乙酸鈉），渦旋1 min，5000 r/min 離心5 min。吸取10 mL 上清液加至15 mL 塑料QuEChERS 萃取凈化管中（含有1200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18、400 mg GCB），渦旋1 min，5000 r/min 離心5 min。吸取2 mL凈化液于10 mL 塑料試管中，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 乙酸乙酯復溶，過0.22 μm 有機濾膜，待檢測。

內標后置法：除以下操作外，其余步驟均與內標前置法相同：①茶葉樣品置于50 mL 塑料離心管后，不加入200μL內標溶液；②凈化液氮氣吹至近干后，先加入20μL內標溶液，再加入1 mL乙酸乙酯復溶。

1.2.3 儀器條件氣相色譜條件：色譜柱為SH-RXi-5Sil MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min 升至125 ℃，再以10 ℃/min 升至300 ℃，保持10 min；進樣方式：不分流進樣；柱流量：1.5 mL/min；載氣：氦氣（純度大于99.999%）；進樣量：1μL。

質譜條件：電子轟擊離子源（EI）；離子源電壓：70 eV；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲時間：4 min；碰撞氣：氬氣（純度大于99.999%）；掃描方式：多反應離子監測模式（MRM）。

2 結果與討論

2.1 GC-MS/MS條件優化

將400μg/L 的37種農藥混合標準工作溶液進行單四極桿質譜全掃描，利用譜庫檢索間接確定各農藥的保留時間，通過優化柱箱升溫程序，37 種農藥可在22.31 min 內得到有效分離。再通過Smart Database MRM 優化工具確定各農藥的碎片離子信息和碰撞能量，具體參數見表1。在優化的質譜條件下，37種農藥在綠茶空白基質匹配標準溶液（400μg/L）中的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 37種農藥在綠茶空白基質匹配標準溶液（400μg/L）中的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of green tea blank matrix-matched standard solution（400μg/L）of the 37 pesticides

表1 37種農藥及內標的保留時間和質譜參數Table 1 Retention times and MS parameters of the 37 pesticides and internal standard

2.2 提取溶劑的選擇

茶葉中農藥殘留檢測的常用提取溶劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷等。為確定最優的提取溶劑，分別采用乙腈、乙酸乙酯、丙酮、丙酮-正己烷（1∶1，體積比）、正己烷5 種溶劑按照“1.2.2”內標前置法進行綠茶空白基質加標回收實驗，37 種農藥的加標水平為0.1 mg/kg，所有加標樣品均靜置24 h以上。結果表明，不同提取溶劑得到的提取液顏色由深至淺分別為丙酮＞丙酮-正己烷（1∶1）＞乙腈＞乙酸乙酯＞正己烷，且用丙酮、丙酮-正己烷（1∶1）兩種溶劑提取凈化，氮吹后得到的殘渣較多。根據GB/T 27404-2008［20］的要求，當待測農藥含量為0.1 mg/kg 時，回收率應在80%～110%范圍內。通過比較不同溶劑提取后的回收率分布情況（見圖2）可知，使用不同提取溶劑時，平均加標回收率在80%～110%范圍內的農藥數量均不相同，由高到低分別為乙腈（33種）＞乙酸乙酯（27種）＞丙酮（21種）＞丙酮-正己烷（1∶1）＞（20種）＞正己烷（3種）。綜上所述，本文最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑提取后37種農藥的回收率分布（綠茶基質）Fig.2 Recovery distribution of the 37 pesticides in green tea by different extraction solvents

2.3 加水量的確定

茶葉的含水量較低，前處理過程若加入一定量的水進行浸泡，可以增加茶葉細胞的通透性，從而提高農殘的析出。然而，茶葉用水浸泡后，水溶性雜質也隨之溶出并轉移到提取液中，增加凈化難度。加水量越多，水溶性雜質的含量越高，提取液顏色越深，凈化難度越大。通過空白基質加標回收實驗（加標水平為0.1 mg/kg），分別比較了添加0（即不添加水）、5、10、15 mL水時對37種農藥回收率的影響。結果顯示，不加水浸泡，大部分農藥無法被有效提取，有33種農藥的平均回收率在80%以下。加水浸泡后，這一情況得到顯著改善。與添加5、15 mL水相比，添加10 mL水時，有32種農藥的平均回收率在80%～110%范圍內，均高于兩者。因此，實驗選擇加水量為10 mL。

2.4 內標前置法與內標后置法的比較

內標法是質譜分析中常見的定量方法，通過添加內標可以校準前處理和儀器檢測過程的偏差。為比較內標的不同放置方式對回收率的影響，按照“1.2.2”分別用內標前置法和內標后置法對綠茶空白基質進行加標回收實驗，37 種農藥的加標水平為0.1 mg/kg，結果見圖3。由圖可知，采用內標前置法，平均回收率在80%～110%之間的農藥有34種，高于內標后置法（30 種）。另外，平均回收率為80%～110%的大部分農藥，采用內標前置法的回收率與100%的絕對差值低于內標后置法。如乙酰甲胺磷、乙螨唑和毒死蜱，用內標前置法時三者的平均回收率分別為91.4%、93.1%和101%，而用內標后置法的平均回收率分別為83.7%、83.8%和89.7%。其原因可能在于，內標后置法是在前處理結束后上機前加入內標，因QuEChERS 方法中無水硫酸鎂與水放熱導致離心管的溫度升高，可能會使農藥降解損失，且前處理過程中提取、轉移、氮吹等步驟也可能導致農藥損失，這些損失無法用內標后置法進行補償。而內標前置法的內標物是在前處理前加入樣品中，整個前處理和儀器分析過程均伴隨待測目標物，可以更好地校正前處理和儀器帶來的誤差，使農藥的回收率相對穩定，提高了方法的準確度。

圖3 采用內標前置法和內標后置法時37種農藥的回收率分布（綠茶基質）Fig.3 Recovery distribution of the 37 pesticides in green tea by adding ISTD before pre-treatment and after pre-treatment

2.5 基質效應

茶葉成分復雜，在質譜分析過程中可能產生基質效應（ME），導致目標化合物在儀器上的響應增強或減弱，不利于農殘分析。其計算公式為：ME=B/A×100%，其中，A為純溶劑標準溶液中農藥的響應值，B為空白基質標準溶液中相同含量農藥的響應值。ME 低于80%為強基質抑制效應，ME 在80%～100%之間為弱基質抑制效應，ME 在100%～120%之間為弱基質增強效應，高于120%則為強基質增強效應［21］。本文分別用綠茶、紅茶、白茶、黑茶空白基質和乙酸乙酯配制質量濃度為200μg/L 的37種農藥混合標準溶液，上機測試。結果表明，4 種茶葉均以基質增強效應為主，ME 高于120%的農藥數量在4種茶葉中占比均最高，ME低于80%的農藥數量在4種茶葉中均為0。本實驗采用基質匹配標準曲線進行定量，以消除基質效應的影響。通過比較發現，基質溶液中目標化合物的色譜峰形較好，無拖尾現象，而純溶劑中部分目標化合物（如甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果等）的色譜峰形較寬，有明顯拖尾（圖4）。這可能是因為茶葉的基質組分限制了GC 進樣口和色譜柱中產生的活性位點，從而改善了農藥在純溶劑中的峰拖尾情況［22］。

圖4 純溶劑標準溶液（A）和綠茶基質標準溶液（B）中甲胺磷（400μg/L）的色譜圖Fig.4 Chromatograms of methamidophos（400μg/L）in solvent standard（A）and green tea matrix-matched standard（B）

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

按照“1.2.1”分別用綠茶、紅茶、白茶、黑茶空白基質配制質量濃度為0.2、1、2、10、20、100、200、400、800 μg/L 的系列空白基質混合標準工作溶液，以各農藥與內標的峰面積之比為縱坐標，各農藥與內標的質量濃度之比為橫坐標繪制標準曲線。結果表明，在相應的質量濃度范圍內，37種農藥在4種茶葉基質中的相關系數（r2）均大于0.99，呈現出良好的線性關系。以信噪比為3（S/N=3）確定方法檢出限（LOD），以S/N=10確定方法定量下限（LOQ）。結果顯示，37種農藥在綠茶基質中的檢出限為0.3～15.7μg/kg，定量下限為1.0～52.2μg/kg；在紅茶基質中的檢出限為0.2～15.5μg/kg，定量下限為0.7～51.8μg/kg；在白茶基質中的檢出限為0.2～14.5μg/kg，定量下限為0.8～48.4μg/kg；在黑茶基質中的檢出限為0.3～15.3μg/kg，定量下限為0.9～51.1μg/kg。除了乙酰甲胺磷、噠螨靈的定量下限與GB 23200.113標準方法相近外，其余農藥的定量下限均低于標準方法的定量下限（為10～50μg/kg［12］），顯示出較好的靈敏度。結果亦表明，同一種農藥在不同茶葉基質中的檢出限、定量下限數值較為接近。表2為37種農藥在綠茶基質中的線性關系、檢出限與定量下限。

表2 綠茶中37種農藥的線性范圍、相關系數（r2）、檢出限（LOD）、定量下限（LOQ）、加標回收率和相對標準偏差Table 2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs），limits of quantitation（LOQs），spiked recoveries and RSDs of the 37 pesticides in green tea

（續表2）

2.7 回收率與相對標準偏差

對空白綠茶、紅茶、白茶和黑茶樣品進行37 種農藥的加標回收實驗，加標水平為LOQ、2LOQ 和10LOQ，每個水平重復6 次。結果顯示，在不同茶葉以及不同加標水平下，37 種農藥的回收率為70.2%～120%，相對標準偏差（RSD）為1.1%～11%，符合GB/T 27404-2008［20］的要求，表明方法的準確度和精密度均能達到滿意結果。表2為37種農藥在綠茶基質中的回收率與相對標準偏差。

2.8 與文獻方法的比較

將本文建立的方法與文獻報道［23-28］的茶葉農殘檢測方法進行比較，結果見表3。本文采用的QuEChERS 前處理方法有機溶劑用量較少，環境友好，操作簡單，耗時短；運用內標前置方式結合GC-MS/MS 檢測，方法的靈敏度高、回收率好、精密度高。文獻［28］方法與本方法相似，利用QuEChERS和GC-MS/MS檢測茶葉中31種農藥殘留，但采用內標后置法，其檢出限高于本方法，且回收率不理想。

表3 本方法與文獻方法的比較Table 3 Comparison of this method with other methods from references

2.9 實際樣品的測定

利用本方法對2021年下半年至2022年一季度送檢的27份綠茶（主要為漢中仙毫、漢中毛尖、漢中炒青等漢中本地茶葉）、11 份紅茶以及市售的8 份白茶、10 份黑茶進行37 種農藥殘留的檢測。結果顯示，在56份茶葉中，有11份檢出農藥殘留，檢出率為19.6%。共檢出9種農藥，檢出頻次由高到低分別為氯氟氰菊酯（6次）、聯苯菊酯（6次）、毒死蜱（6次）、氯氰菊酯（4次）、甲氰菊酯（4次）、氧樂果（4次）、樂果（2 次）、苯醚甲環唑（2 次）、氰戊菊酯（1 次）。以上檢出農藥的含量均未超過GB 2763-2021 規定的最大殘留限量值。

3 結論

本文利用QuEChERS 前處理技術，采用內標前置方式，建立了茶葉中37種農藥殘留的氣相色譜-串聯質譜檢測方法。通過優化提取條件和內標加入方式，以及采用基質匹配標準曲線定量，解決了前處理過程因目標物損失導致的回收率不高的問題，降低了基質干擾，提高了結果的準確性和穩定性。本方法具有操作簡單、準確高效、成本較低等優點，滿足日常檢測要求，為大批量茶葉農藥殘留檢測提供了新的途徑。