基于溴化銀-銀-碳納米管復合物與核酸適配體的陰極光電化學傳感器檢測赭曲霉素A

周建紅，令玉林，曾伯平，張 衡，鄧克勤

（1.遵義師范學院 生物與農業科技學院，貴州 遵義 563006；2.遵義師范學院 資源與環境學院，貴州 遵義 563006；3.湖南科技大學 化學化工學院，湖南 湘潭 411201）

赭曲霉素A（OTA）是幾種菌株的有毒次生代謝物，其毒性大、分布范圍廣，易對農產品、食品造成污染［1-2］。由于人類與OTA 的過度接觸具有致畸、致癌等風險，世界不同的國家和組織均制定了嚴格的OTA限量標準。如歐盟委員會（EU）對谷物產品中的OTA限量小于3μg/kg［3］，中國國家標準限定谷類、豆類中的OTA標準應低于5μg/kg［4］。

OTA 常見的檢測方法有色譜法［5-6］和免疫分析法［7-8］。適配體傳感器作為一種成本低廉、制備簡單、靈敏度高的分析技術［9-11］，也被用于OTA 的檢測，并顯示了對目標分子的特異性生物識別能力。近年來，新涌現的光電化學傳感器（尤其是陰極光電化學傳感器）具有操作方便、背景低、靈敏度高等優點，引起了廣泛關注［12-16］，進一步開發特殊的陰極光電活性材料可提高陰極光電化學傳感器的性能。AgBr 具有光學不穩定性，通過部分被還原為金屬Ag 顯示的局域表面等離子體共振效應（LSPR）可提高光吸收效率。此外，金屬Ag 的LSPR 效應還與周圍介質密切相關，通過采用各種支撐材料（如g-C3N4、CNTs、BiOI等）優化金屬Ag附近的電場，可增強光吸收，提高光活性材料的性能［15-16］。

目前，基于OTA 適配體的陰極光電化學傳感器研究不多。本文通過簡單的水熱法和光還原法制備了AgBr-Ag-CNTs，利用金屬Ag 的LSPR 效應和CNTs優異的電子傳輸性能，將AgBr 的光生電子快速傳輸給溶液中的光電子受體K3［Fe（CN）6］，有效地降低了光生電子——空穴復合，顯著提升了陰極光電流強度；進一步采用AgBr-Ag-CNTs 作為陰極傳感界面固定OTA 核酸適配體，對目標分子進行特異性識別，因形成的適配體/OTA 配合物具有剛性的三級結構和弱導電性，能有效阻礙傳感界面對光的吸收及抑制光電子向電子受體傳遞［17］，顯著降低光電流信號（原理如圖1 所示），以此構建了用于檢測OTA 的光電適配體傳感器。本傳感器制備簡單、成本低、靈敏度高、抗干擾強，可用于實際樣品中OTA的測定，具有潛在的應用價值。

圖1 檢測OTA的示意圖Fig.1 Schematic diagram for detection of OTA

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

采用X-射線光電子能譜（XPS，PHI5300）、掃描電子顯微鏡（SEM，Sigma 500，德國Zeiss公司）、能量色散光譜儀（EDS，XFlash 6130，布魯克科技有限公司）、X-射線衍射儀（XRD-6000，日本島津公司）表征材料。光電測試使用光電化學系統（PEAC 200A，天津艾達恒晟科技發展有限公司）和CHI 760C電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）。實驗采用LED白光光源（20 mW/cm2），三電極體系分別為ITO工作電極、Pt絲對電極和飽和甘汞輔助電極（SCE）。

碳納米管（CNTs，直徑20 ～30 nm，長度0.5 ～2.0 μm）、AgNO3、K3［Fe（CN）6］、K4［Fe（CN）6］、KBr、乙醇胺、殼聚糖（CS）、Tris-HCl、戊二醛（GLD）購于上海阿拉丁公司。玉米赤霉烯酮（ZEA）、赭曲霉素A（OTA）、赭曲霉素B（OTB）、黃曲霉素B1（AFB1）由英格蘭New England Biolabs，Inc. 提供。OTA 的核酸適配體5’-NH2-（CH2）6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3′由上海生工公司合成。所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 AgBr-Ag-CNTs的制備

先將多壁碳納米管（CNTs）在濃HNO3和H2SO4（3∶1，體積比）中酸化處理［18］，然后采用溶劑熱法制備AgBr-Ag-CNTs。具體方法如下：分別使用25 mL 乙二醇溶解240 mg KBr 和340 mg AgNO3，將20 mg CNTs 加入AgNO3溶液中，緩慢磁攪拌1 h 后，將KBr 溶液緩慢滴加到上述懸浮液中，攪拌30 min，置于紫外光下照射1 h 后，將混合液倒入高壓反應釜中，160 ℃下加熱6 h，離心、洗滌并干燥，制得AgBr-Ag-CNTs。為了比較性能，采用相似方法，在不加入CNTs 的條件下制備AgBr-Ag。AgBr也在無CNTs和紫外光照下制得。

1.3 核酸適配體傳感器的制備與OTA的檢測

將AgBr-Ag-CNTs分散在0.1%殼聚糖（CS）溶液中，取8μL AgBr-Ag-CNTs分散液（5.0 mg/mL）滴于潔凈的ITO表面，干燥后，用戊二醛（2.5%）活化CS膜30 min，然后將8μL核酸適配體（1.0μmol/L）滴于ITO表面并在4 ℃下培育12 h，最后用乙醇胺封閉活性位點30 min。傳感器在制備過程的每一步都需仔細清洗。

OTA的檢測采用Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl和20 mmol/L MgCl2，pH 8.0）。取10μL不同濃度的OTA樣品溶液滴加至傳感器表面，室溫反應30 min，洗凈。在0.1 V電壓下，以0.1 mol/L KCl為電解質溶液，20μmol/L K3［Fe（CN）6］作為光電子受體，檢測傳感器與OTA反應前/后的光電流強度（I0/I）。

2 結果與討論

2.1 材料的表征

利用掃描電鏡（SEM）表征了AgBr-Ag-CNTs復合物的形貌和尺寸。從圖2A可觀察到，復合物呈類立方體形態，CNTs嵌入或覆蓋在立方體表面，其尺寸約0.4 ～2.0μm。AgBr-Ag-CNTs的EDS譜圖表明其特征峰分別對應C、O、Br、Ag四種元素（圖2B），證實了復合材料中存在CNTs和AgBr。其中，Ag原子占32.86%，Br原子占26.41%。過量的Ag原子（6.46%）可能來自Ag+的還原。圖2C為AgBr-Ag-CNTs的XRD譜圖，其在31.0°、44.3°、55.0°、64.5°、73.2°的特征衍射峰，分別對應AgBr立方晶相的（200）、（220）、（222）、（400）、（420）晶面（JCPDS No. 06-0438）［19］。未發現明顯的Ag特征峰，可能是由于AgBr-Ag-CNTs中金屬Ag含量較低或粒徑太小所致。進一步利用XPS分析AgBr-Ag-CNTs的元素組成和化學狀態（圖2D-F）。C 1s和O 1s的特征峰來自CNTs（圖2D）。Ag的XPS峰可拆分為4個擬合峰。367.1 eV和373.2 eV處的兩個峰屬于AgBr中Ag 3d5/2和Ag 3d3/2，368.0 eV和374.2 eV處的兩峰屬于金屬Ag［20］，這表明Ag0的存在（圖2E）。Br 3d在68.0 eV和69.1 eV處有擬合峰，分別屬于Br 3d5/2和Br 3d3/2的結合能（圖2F），表明元素Br主要以Br-存在［20］。

圖2 AgBr-Ag-CNTs的SEM圖（A）、EDS譜圖（B）、XRD譜圖（C）和XPS譜圖（D-F）Fig.2 SEM image（A），EDS spectrum（B），XRD pattern（C）and XPS spectrum（D-F）of AgBr-Ag-CNTs

進一步比較了幾種材料的陰極光電化學活性（見圖3）。在外加偏壓0.1 V條件下，AgBr顯示較低的陰極光電流，AgBr-Ag的陰極光電流強度明顯增強。與前二者相比，AgBr-Ag-CNTs的光電流強度大大提升，其強度分別為AgBr的2.7倍和AgBr-Ag的2.1倍，這表明AgBr-Ag-CNTs擁有更高的陰極光電化學活性。

圖3 不同材料修飾的ITO玻璃在0.1 V偏壓下的光電流Fig.3 Photocurrent of ITO glass modified by different materials at potential of 0.1 V

2.2 K3［Fe（CN）6］的影響

為提高AgBr-Ag-CNTs在光激發下的電子-空穴對（e-/h+）的分離效率，提高光電流信號，構建高性能傳感器，本實驗考察了K3［Fe（CN）6］作為光電子受體時的信號變化。由圖4A可見，無K3［Fe（CN）6］時，光照下的電流（曲線a’）比無光照時的電流（曲線a）明顯增強；加入K3［Fe（CN）6］后，開啟燈源時電流急劇增加（圖4B，b’），與曲線a’相比，對應電位的電流大大增強。為了進一步驗證K3［Fe（CN）6］的作用，本實驗采用恒電位法比較了AgBr-Ag-CNTs/ITO電極在有/無K3［Fe（CN）6］時的光電流。結果顯示，在0.1 V電位下，當存在K3［Fe（CN）6］作為光電子受體時，電極的光電流是無K3［Fe（CN）6］時的2.9倍，且光電流在瞬間達到最大。這表明光照條件下，AgBr導帶激發出的光電子可經CNTs快速傳遞到溶液中的K3［Fe（CN）6］，促進其還原為K4［Fe（CN）6］。由于CNTs具有優良的電荷傳輸效率，可加速電荷分離并抑制電子-空穴對（e-/h+）復合，從而顯著增強光電流信號［16］。

2.3 傳感器的構建

利用電化學阻抗譜（EIS）研究了核酸適配體傳感器的制備過程。圖5A顯示AgBr-Ag-CNTs/ITO的電荷轉移電阻（Rct）相對較低（曲線a）。修飾CS膜后，增強了Rct值（曲線b）；固定適配體和封閉乙醇胺后，Rct值顯著增加（曲線c）；與OTA反應后進一步降低了Rct（曲線d）。采用瞬態光電流對傳感器的制備進行考察（見圖5B），可觀察到AgBr-Ag-CNTs/ITO產生極高的陰極光電流（曲線a）。隨著CS的修飾、核酸適配體的固定和乙醇胺的封閉，光電流逐步降低（曲線b、c）。與OTA反應后，光電流密度進一步減小（曲線d），這表明傳感器已成功制備且實現了對目標OTA的特異性識別。

圖5 不同電極在5 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］溶液中的電化學阻抗譜（A），以及0.1 V偏壓下，不同電極在20μmol/L K3［Fe（CN）6］中的光電流（B）Fig.5 EIS curves of different electrodes in 5 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］solution（A），and photocurrent response of different electrodes at 0.1 V in 0.1 mol/L KCl containing 20μmol/L K3［Fe（CN）6］（B）a：AgBr-Ag-CNTs/ITO；b：after CS modification；c：after aptamer and ethanolamine immobilization；d：after incubation with OTA（1.0 ng/mL）

2.4 實驗條件的優化

外加電位是影響光電流信號的重要因素。如圖4B所示，陰極光電流強度隨掃描電位（0.6 ～0.05 V）的降低而升高，但掃描電位＜0 V時，AgBr-Ag-CNTs不穩定，當掃描電位低于0.05 V時，負向電流急劇升高，這可能是由于AgBr-Ag-CNTs復合物中的Ag+被快速還原所致。因此，本實驗選擇0.1 V作為偏置電位。

圖4 AgBr-Ag-CNTs/ITO在0.1 mol/L KCl（A）和20μmol/L K3［Fe（CN）6］（B）溶液中于黑暗（a，b）和光照（a’，b’）條件下的循環伏安圖Fig.4 CV curves of AgBr-Ag-CNTs/ITO in 0.1 mol/L KCl solution（A）and 20μmol/L K3［Fe（CN）6］（B）under darkness（a，b）and light irradiation（a’，b’）

核酸適配體在光電陰極界面的固定密度影響光電化學響應。實驗發現，在適配體濃度為0 ～1.0μmol/L范圍內，光電流強度隨濃度的升高急劇下降。在1.0 ～5.0μmol/L范圍，光電流緩慢下降最后趨于穩定。考慮到高密度的適配體會阻礙光電子轉移，而低密度的適配體不能有效捕獲OTA并與之反應。因此，本實驗采用1.0μmol/L的適配體濃度進行后續實驗。

2.5 性能檢測

在最佳實驗條件下，測試了傳感器與不同濃度OTA 反應后的陰極光電流響應（圖6A）。在4.0 pg/mL ～2.5 ng/mL 范圍內，光電流密度隨OTA 質量濃度的升高而降低，且降低的光電流ΔI（I-I0）與OTA質量濃度的對數（logC）呈線性關系，線性方程為：ΔI（μA）＝-0.179+0.917 logC（pg/mL）（圖6A，插圖），相關系數（r2）為0.994，檢出限（LOD）為1.5 pg/mL，遠低于歐盟和中國規定的谷物和豆類原料中OTA的限定含量［3-4］。

圖6 光電流響應與OTA濃度的關系（A），及方法對OTA檢測的特異性（B）Fig.6 Relationship between photocurrent response and concentration of OTA（A），and specificity of the method for OTA assay（B）concentration of OTA：1.0 ng/mL；concentration of aflatoxin B1（AFB1），zearalenone（ZEA），and ochratoxin B（OTB）：50.0 ng/mL；inset：the log-linear correlation between ΔI and content of OTA

利用AgBr-Ag-CNTs/ITO 對1.0 ng/mL OTA 進行特異性測試。如圖6B所示，與空白溶液相比，傳感器對質量濃度為50.0 ng/mL 的黃曲霉素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、赭曲霉素B（OTB）的光電流響應降低小于7.5%；當三者與OTA 混合后，傳感器響應的光電流與僅含OTA 反應液的光電流相似。結果表明該方法對OTA具有良好的選擇性。

為驗證該傳感器的可靠性，本課題組從當地超市購買了紅酒、豆漿和花生牛奶3 種不同樣品，采用加標的方式考察其回收率，每個樣品的加標質量濃度為100 pg/mL，平行測定3 次，測得回收率為92.0%～108%，相對標準偏差（RSD）低于9.3%，表明該傳感器可用于實際樣品中OTA的檢測。

3 結論

本文采用水熱法和光化學還原法制備了具有優良陰極光電化學活性的AgBr-Ag-CNTs復合納米材料。采用該材料作為陰極光電傳感基底，以K3［Fe（CN）6］作為光電子受體，制備了OTA 適配體傳感器，于4.0 pg/mL ～2.5 ng/mL范圍實現了對目標分子OTA 的選擇性檢測，檢出限為1.5 pg/mL。本傳感器制備簡單、成本低、靈敏度高、抗干擾強，具有潛在的應用價值。