青蒿提取物治療兔球蟲(chóng)病效果評(píng)價(jià)

王麗坤，金振華，張國(guó)華，張 備，鹿凌巖，郝彩虹，劉珈羽，田秋豐

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

兔球蟲(chóng)病是對(duì)兔養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)疾病之一，一年四季均可發(fā)生[1]，各年齡段均易感，斷奶至4 月齡的幼兔尤為易感[2]。兔球蟲(chóng)病一旦暴發(fā)，常危及整個(gè)兔養(yǎng)殖場(chǎng)，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。兔球蟲(chóng)的生活史包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖等3個(gè)階段[3]，其中孢子生殖過(guò)程通常在宿主體外進(jìn)行，裂殖生殖和配子生殖則于宿主細(xì)胞內(nèi)完成，兔經(jīng)口感染孢子化的球蟲(chóng)卵囊而發(fā)病[4]。兔球蟲(chóng)病的防治長(zhǎng)期依賴化學(xué)類藥物和抗生素類藥物，進(jìn)而引發(fā)耐藥性和藥物殘留問(wèn)題[5]。中藥因毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)有望成為防治兔球蟲(chóng)病的新選擇。

我國(guó)古代的中藥學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，青蒿具有良好的抗菌、殺蟲(chóng)作用[6]。青蒿屬菊科植物中的黃花蒿種屬，其主要有效成分青蒿素在國(guó)際上獲得了極大的認(rèn)可，具有抗球蟲(chóng)、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等作用[7-8]。青蒿提取物對(duì)兔球蟲(chóng)卵囊體外孢子化具有較好的抑制作用，且隨著藥物濃度的增高，卵囊孢子化呈下降趨勢(shì)，但無(wú)法殺滅兔球蟲(chóng)卵囊[9]。有研究表明，日糧中添加青蒿花枝干粉治療兔球蟲(chóng)病可產(chǎn)生與地克珠利相似的治療效果，且未出現(xiàn)球蟲(chóng)感染強(qiáng)度反彈，還可顯著促進(jìn)動(dòng)物體增重，降低飼料的成本[10]。本研究利用超聲波提取法提取青蒿有效成分，以商品化妥曲珠利為對(duì)照，評(píng)價(jià)青蒿提取物治療兔球蟲(chóng)病的治療效果，以期為兔球蟲(chóng)病的防治提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1～2 月齡的健康幼兔購(gòu)自齊齊哈爾種兔場(chǎng)，通過(guò)糞便檢查篩選未感染兔球蟲(chóng)幼兔30只作為試驗(yàn)動(dòng)物，在已消毒環(huán)境下飼養(yǎng)1 w。

1.1.2 兔球蟲(chóng)卵囊

兔球蟲(chóng)卵囊分離自大慶市龍鳳區(qū)某兔場(chǎng)，采集已人工感染球蟲(chóng)的兔糞樣置于容器，應(yīng)用飽和鹽水漂浮法收取上液置于離心管；6 000 r/min 離心5 min，沉淀物放入含有2.5%重鉻酸鉀溶液的平皿，25 ℃溫箱中孵育72 h，孢子化的卵囊保存于4 ℃冰箱。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

青蒿購(gòu)自黑龍江省康復(fù)藥材有限責(zé)任公司。妥曲珠利混懸液（批號(hào)：KPOAL 4L）為拜耳（四川）動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)。其他試劑均為分析純。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

分析天平（上海梅特勒-托利多有限公司）、恒溫超聲提取機(jī)（北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）、低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、生物顯微鏡（上海尼康儀器有限公司）；載玻片、蓋玻片等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青蒿有效成分的提取

稱取一定量青蒿粉末，按照料液比1∶50 g/mL 加入無(wú)水乙醇，將料液放入恒溫超聲提取機(jī)。設(shè)置超聲波強(qiáng)度120 W、溫度50 ℃、超聲5 s、間歇5 s、超聲時(shí)間30 min。5 000 r/min 離心10 min，0.45 μm 濾膜過(guò)濾，藥液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后保存。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將幼兔隨機(jī)分為6組，每組5只，各組均在同一條件下分籠飼養(yǎng)。設(shè)置空白對(duì)照組（不感染不用藥）、感染不用藥對(duì)照組；青蒿提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組，每只幼兔分別按照每日每kg體重喂服5、10、15 g青蒿粉末提取后的濃縮物；妥曲珠利組每只幼兔按照每日每kg體重喂服托曲珠利0.4 mL。

1.2.3 球蟲(chóng)卵囊人工感染

各感染組幼兔均人工感染孢子化兔球蟲(chóng)卵囊5×104個(gè)/只，各用藥組均于感染當(dāng)日開(kāi)始用藥，感染后第15 d撲殺剖檢。

1.2.4 球蟲(chóng)卵囊計(jì)數(shù)

分別在人工感染球蟲(chóng)卵囊第0、5、10、15 d收集各組試驗(yàn)兔糞便，取2 g 新鮮糞便置于干凈的100 mL 燒杯內(nèi)，加入8 mL飽和食鹽水，玻璃棒搗碎混勻；再加入50 mL飽和食鹽水混勻，60目篩網(wǎng)過(guò)濾，吸取濾液充滿2個(gè)計(jì)數(shù)室；顯微鏡載物臺(tái)上靜置3～5 min，在10倍物鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，分別查完2 個(gè)計(jì)數(shù)室100 個(gè)方格內(nèi)的卵囊數(shù)量n1和n2，計(jì)算每克糞便中卵囊數(shù)量（OPG值）。

式中：2表示2個(gè)計(jì)數(shù)室；0.15表示計(jì)數(shù)室內(nèi)每個(gè)方格的體積；60表示糞便過(guò)濾篩的目數(shù)；2表示糞便重量2 g。

卵囊比數(shù)為0～1% 時(shí)，卵囊值為0；卵囊比數(shù)為2%～25%時(shí)，卵囊值為5；卵囊比數(shù)為26%～50%時(shí)，卵囊值為10；51%～75% 時(shí)，卵囊值為20；卵囊比數(shù)為76%～100%時(shí)，卵囊值為40。

1.2.5 相對(duì)增重率與存活率

所有健康幼兔在試驗(yàn)前稱重記錄，撲殺前稱重記錄。試驗(yàn)期間，記錄各組幼兔死亡情況，對(duì)死亡的幼兔及時(shí)剖檢，確定死亡原因。

1.2.6 腸道病變計(jì)分

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：腸道中無(wú)眼觀異常；1分：小腸充血，黏膜稍增厚、呈淡黃色；2分：小腸充血，黏膜肥厚、充血，黏膜面有少量白色小結(jié)節(jié)，黏液增多，呈桃紅色；3分：小腸高度充血，黏膜肥厚，黏膜彌散大量小白結(jié)節(jié)，腸腔內(nèi)黏液黏稠，呈黃紅色；4分：空腸、回腸腫脹，黏膜呈腦回狀，腸腔內(nèi)充滿橙黃色黏液塊或麩皮狀物，黏膜上密布小結(jié)節(jié)或結(jié)節(jié)斑，部分黏膜脫落。

1.2.7 抗球蟲(chóng)指數(shù)（ACI）

按照美國(guó)默克公司方法，ACI＜120表示藥物對(duì)球蟲(chóng)無(wú)效；120＜ACI＜160 表示低效藥物；160＜ACI＜180 表示中等效力的抗球蟲(chóng)藥物；ACI＞180表示高效抗球蟲(chóng)藥。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行整理分析，采用X2檢驗(yàn)比較。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組不同時(shí)間球蟲(chóng)OPG值變化情況（見(jiàn)表1）

由表1可知，試驗(yàn)第5、10、15 d，各感染組OPG值均顯著高于空白的對(duì)照組（P＜0.05），表明感染成功。試驗(yàn)第5、10、15 d，各用藥組幼兔糞便中兔球蟲(chóng)卵囊數(shù)均顯著低于感染不用藥對(duì)照組（P＜0.05），表明各用藥組的藥物均具有一定的抗球蟲(chóng)作用。

表1 各組不同時(shí)間球蟲(chóng)OPG值變化情況Tab.1 Changes of OPG value of coccidia at different time in each group單位：×104

各青蒿提取物組幼兔糞便中兔球蟲(chóng)卵囊數(shù)隨著藥物用量的增加，幼兔糞便中兔球蟲(chóng)卵囊數(shù)明顯降低；經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)第15 d 時(shí)，青蒿提取物高劑量組與妥曲珠利組在幼兔糞便中的兔球蟲(chóng)卵囊數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其他用藥組（P＜0.05）；結(jié)果表明，青蒿提取物中劑量組和低劑量組的抗球蟲(chóng)效果較差。

2.2 各組治療效果總體評(píng)價(jià)（見(jiàn)表2）

由表2可知，各用藥組用藥后，通過(guò)卵囊值、增重情況、存活情況和腸道病變情況綜合評(píng)價(jià)藥物對(duì)兔球蟲(chóng)病的治療效果。結(jié)果顯示，青蒿提取物高劑量組和妥曲珠利組的ACI 均大于180，青蒿提取物中劑量組和青蒿提取物低劑量組的ACI 分別為178 和149；表明高劑量青蒿提取物和妥曲珠利為高效抗球蟲(chóng)藥物，中劑量和低劑量的青蒿提取物分別為中等效力和低等效力的抗球蟲(chóng)藥。

表2 各組治療效果總體評(píng)價(jià)Tab.2 Overall evaluation of treatment effect in each group

3 討論

兔球蟲(chóng)病主要危害兔的肝臟和盲腸。兔球蟲(chóng)的蟲(chóng)體寄生于肝臟，造成部分肝細(xì)胞變性和壞死，影響肝臟的消化吸收和解毒功能；蟲(chóng)體寄生于腸內(nèi)，則破壞腸黏膜上皮細(xì)胞，使黏膜上皮細(xì)胞大量變性壞死、崩解，成為有毒物質(zhì)，使機(jī)體發(fā)生自體中毒，進(jìn)而導(dǎo)致死亡[12]。青蒿性苦、寒，入肝、膽經(jīng)，苦寒不傷胃，能夠宣化胃腸濕熱，而上述功效主要?dú)w功于青蒿的主要成分青蒿素，可針對(duì)肝臟、腸道球蟲(chóng)發(fā)揮抑制作用。此外，青蒿素還可以緩解機(jī)體炎性反應(yīng)，具有對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的功效[13]，從而對(duì)兔球蟲(chóng)病起到標(biāo)本兼治的目的。因此，青蒿提取物可作為化學(xué)類抗球蟲(chóng)藥物的替代藥物，應(yīng)用于兔球蟲(chóng)病治療。

與妥曲珠利等化學(xué)類藥物相比，青蒿提取物能夠更為安全、經(jīng)濟(jì)、有效地防治兔球蟲(chóng)病。2015 年的《中國(guó)藥典》中記載，青蒿具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃的功效。青蒿應(yīng)用于兔球蟲(chóng)治療可以解決化學(xué)藥物造成的耐藥性以及藥物殘留的問(wèn)題，緩解環(huán)境污染，提高生物安全。本研究中，高劑量使用青蒿提取物可產(chǎn)生與妥曲珠利相近的治療效果；且青蒿為草本類植物，屬菊科[14]，種類繁多，分布廣泛，一般產(chǎn)量較高、成本低，易購(gòu)買或采集。因此，研究開(kāi)發(fā)青蒿有效成分提取方法及其提取物功效，對(duì)青蒿素人工合成技術(shù)的改進(jìn)或研發(fā)與青蒿素具有協(xié)同作用的某些藥物的復(fù)方制劑，在球蟲(chóng)病的防治方面具有良好的應(yīng)用前景[15]。

本研究采用超聲波提取方法提取青蒿的有效成分，不僅克服了傳統(tǒng)的煎煮法有效成分提取不充分、提取時(shí)間長(zhǎng)和高溫易破壞青蒿有效成分等弊端，而且該方法對(duì)儀器設(shè)備要求不高，適用于基層養(yǎng)殖場(chǎng)。本研究提供了一種方便、安全、環(huán)保、高效治療兔球蟲(chóng)病的新方法，根據(jù)中獸醫(yī)辯證理論，進(jìn)一步研發(fā)質(zhì)優(yōu)價(jià)廉、高效低毒、工藝簡(jiǎn)單、使用方便的中藥組方制劑，為兔球蟲(chóng)病的防治及養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展提供參考。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在感染后5 d內(nèi)，感染不用藥組幼兔糞便中兔球蟲(chóng)卵囊數(shù)與其他組相比雖存在差異，但不顯著；感染第5～10 d后，感染不用藥組幼兔兔球蟲(chóng)卵囊數(shù)明顯增多；感染第10 d，其他各用藥組幼兔糞便中的兔球蟲(chóng)卵囊數(shù)明顯減少，說(shuō)明藥物在第5 d后開(kāi)始發(fā)揮作用效果。

綜上所述，給予幼兔高劑量的青蒿提取物具有較好的治療效果，用藥后第15 d，幼兔的癥狀已完全消失，幼兔糞便中的兔球蟲(chóng)卵囊數(shù)明顯得到控制，且高劑量的青蒿提取物能夠促進(jìn)兔進(jìn)食，提高相對(duì)增重率，腸道病變減輕，故使用青蒿提取物高劑量可有效抑制兔球蟲(chóng)病暴發(fā)，相對(duì)應(yīng)用妥曲珠利組治療效果更好。