某院2015—2019年肺炎克雷伯菌的耐藥性及耐藥基因分析

胡小騫 王琴

(安徽醫科大學第二附屬醫院，合肥 230601)

肺炎克雷伯菌(KP)最初于1882年由Friedlander[1]發現，其廣泛存在于自然界中，包括土壤、水質及動物體內。KP是人體內的常見病原菌，當機體免疫力低下或定植部位發生變化時，可引起呼吸道、泌尿道、血液感染，甚至是敗血癥[2]。近年來，由于第三代頭孢菌素及碳青霉烯類抗生素的不合理使用，產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)及耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌逐年增加[3-4]。CR-KP的泛耐藥性、強致病性、高傳染性，增大了臨床抗感染治療及耐藥菌防控的難度[5-6]。本研究通過分析安徽醫科大學第二附屬醫院2015—2019年2416株KP的臨床分布及對常用抗菌藥物的耐藥情況，研究5年來KP耐藥性的變遷，分析CR-KP的耐藥基因型，為臨床抗感染治療及合理用藥提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

回顧性分析安徽醫科大學第二附屬醫院2015年1月—2019年12月臨床分離的肺炎克雷伯菌，剔除同一患者的重復菌株，共計2416株。選取2019年內科重癥監護病區(ICU)的19株CR-KP進行全基因組測序。

1.1.2 試劑與儀器

采用法國VITEK-2 Compat全自動細菌分析系統和配套試劑GN/GN13，進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗，藥敏試驗采用微量稀釋法(MIC法)和K-B紙片擴散法，藥敏紙片及M-H培養基購自Oxoid公司，質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603購自國家衛健委臨床檢驗中心，使用天根生化科技有限公司的試劑盒進行細菌基因組DNA的提取，DNA Marker D、4S Red plus核酸染色劑、上樣緩沖液均購于上海生工生物工程股份有限公司，DNA產物濃度及純度測定使用英國Biochrom公司的超微量分光光度計，運用上海一恒科學儀器有限公司恒溫培養搖床進行細菌液體培養，使用美國Bio-Rad公司的電泳儀進行瓊脂糖凝膠電泳，采用美國Bio-Rad凝膠成像系統進行瓊脂糖凝膠的成像。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養、鑒定及藥敏實驗

依據《臨床微生物樣本采集規范》采集標本，參照《全國臨床檢驗操作規程(第4版)》，在血瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿上按照四區劃線原則進行接種，于CO2恒溫培養箱(36℃±1℃)培養24～48 h，采用法國VITEK-2 Compat全自動細菌分析系統進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗。參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)當年標準判定細菌的藥敏結果，使用微量稀釋法(MIC法)和K-B紙片擴散法對CR-KP菌株進行表型確認，CR-KP藥敏結果判定標準為對任一種碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南、多尼培南或厄他培南)耐藥的肺炎克雷伯菌。

1.2.2 細菌基因組DNA提取

復蘇CR-KP菌株于LB固體培養基上，37℃培養24 h后，挑取單克隆CR-KP菌株于LB液體培養基中，37℃、220 r/min搖菌過夜。取細菌培養液1 mL，10000 r/min離心1 min，吸凈上清液，保留菌體沉淀，使用DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

1.2.3 基因組DNA提取物質量控制標準

將DNA提取產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用超微量分光光度計檢測純度和濃度。純度要求菌株DNA產物的A260:A280在1.8～2.0范圍之內，避免RNA污染；DNA濃度≥20 ng/μL，條帶清晰無雜帶，總量在1.0～2.0 μg范圍內。

1.2.4 細菌全基因組測序

運用上海生工生物有限公司Illumina Hiseq2500測序平臺對菌株進行全基因組測序，基于Illumina平臺的測序，是對核酸提取樣本進行建庫、擴增測序、質控的3個主要步驟。

1.2.5 測序結果組裝

在Linux或Centos系統中運行SPAdes-2.0軟件將測序原始FASTQ結果拼接為FASTA文件，運行命令參考SPAdes-2.0軟件網址https://github.com/ablab/spades。

1.2.6 耐藥基因檢測

運用丹麥技術大學(DTU)基因組流行病學中心(CGE)網站(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)的ResFinder 4.0工具，對19株CR-KP的contigs進行耐藥基因型篩選，獲得其攜帶的耐藥基因。運用MORPHEUS網站(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)在線制作19株CR-KP的耐藥基因熱圖，實現耐藥基因分布可視化。

1.2.7 統計學分析

采用WHONET5.6軟件對菌株的標本來源、科室分布、檢出率及耐藥率進行數據收集，運用SPSS 20.0軟件對5年期間菌株的檢出率、耐藥率進行比較及趨勢統計分析。計數資料以百分比表示，率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，趨勢性分析采用趨勢χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌分布

2015—2019年期間，肺炎克雷伯菌的分離率分別為8.61%(378/4392)、9.84%(448/4555)、8.66%(381/4401)、10.5 1%(622/5916)、11.09%(587/5294)，5年分離率之間的差異有統計學意義(χ2=26.800，P＜0.001)，呈上升趨勢(χ2趨勢=18.190，P＜0.001)，見表1。2015—2019年肺炎克雷伯菌構成比較高的科室為內科ICU23.2%(561/2416)、外科ICU 19.1%(461/2416)、呼吸內科18.8%(454/2416)、神經內科10.9%(263/2416)。2015—2019年肺炎克雷伯菌構成比較高的標本為痰液51.7%(1249/2416)、尿液11.3%(273/2416)、血液7.5%(181/2416)、分泌物5.8%(140/2416)。

表1 2015—2019年肺炎克雷伯菌在全部臨床分離株中的分離情況Tab.1 Isolation of Klebsiella pneumoniae in all clinical isolates from 2015 to 2019

2.2 肺炎克雷伯菌抗菌活性

2015—2019年期間，肺炎克雷伯菌對18種抗菌藥物的耐藥率呈上升趨勢，除替加環素的耐藥率差異無法統計外，對其他各類抗菌藥物的耐藥率差異均有統計學意義(P＜0.001)。對亞胺培南、美羅培南耐藥率分別從2015年的2.9%和3.0%上升至2019年的16.0%和13.7%，頭孢他啶和頭孢吡肟耐藥率分別從12.7%和10.1%上升至24.2%和21.1%，頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率分別從2015年的3.2%和4.2%上升至2019年的16.8%和16.5%，環丙沙星、左氧氟沙星耐藥率分別從18.3%和14.8%上升至29.1%和26.6%，阿米卡星和慶大霉素耐藥率分別從4.2%和18.5%上升至12.8%和28.3%。本院自2017年開始對替加環素的MIC值進行監測，2017—2019年肺炎克雷伯菌對替加環素的耐藥率均為0，見表2。

表2 2015—2019年各年份肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的抗菌活性比較Tab.2 Comparison of the antibacterial activity of Klebsiella pneumoniae against commonly used antibiotics in various years from 2015 to 2019

2.3 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌分布

2015—2019年各年度檢出CR-KP占肺炎克雷伯菌比例分別為3.70%(14/378)、10.04%(45/448)、18.90%(72/381)、19.29%(120/622)、17.55%(103/587)，5年檢出率之間的差異有統計學意義(χ2=63.973，P＜0.001)，呈上升趨勢(χ2趨勢=46.176，P＜0.001)，見表3。2015—2019年CR-KP構成比較高的科室為外科ICU 14.4%(51/354)、內科ICU 10.2%(36/354)、呼吸ICU 8.5%(30/354)、急診ICU 2.0%(7/354)。2015—2019年CR-KP構成比較高的標本為痰液43.8%(155/354)、尿液10.7%(38/354)、分泌物7.1%(25/354)、血液6.5%(23/354)。

表3 2015—2019年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的檢出情況Tab.3 Detection of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae from 2015 to 2019

2.4 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌抗菌活性

2015—2019年CR-KP對各類抗菌藥物呈現出不同程度的耐藥，總體呈現上升趨勢。除對慶大霉素的耐藥率差異無統計學意義(P=0.105)、替加環素的耐藥率差異無法統計外，對其他各類抗菌藥物的耐藥率差異均有統計學意義(P＜0.05)。其中對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別從2015年的92.9%和77.8%上升至2019年的100.0%和98.8%，對頭孢菌素的耐藥率呈上升趨勢，對頭孢他啶和頭孢曲松的耐藥率分別從2015年的64.3%和78.6%上升至2019年的98.1%和99.0%，對環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別從50.0%和42.9%上升至91.3%和91.3%，對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別從42.9%和71.4%上升至68.0%和83.5%。對替加環素的耐藥率均為0(表4)。

表4 2015—2019年各年份耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的抗菌活性比較Tab.4 Comparison of antibacterial activities of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae against commonly used antibiotics in various years from 2015 to 2019

2.5 ICU耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結果

選取2019年內科ICU的19株CR-KP進行WGS檢測及耐藥基因分析，檢測出15種耐藥基因，繪制耐藥基因熱圖，見圖1。其中，攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrS1)、磷霉素耐藥基因(fosA)、四環素耐藥基因(tetA)、氯霉素耐藥基因(catA2)均有19株(100%)；氨基糖苷類耐藥基因為aadA2b和rmtB，同時攜帶兩者的菌株有17株(89.5%)；磺胺類藥物耐藥基因為sul1和sul2，同時攜帶兩者的菌株有17株(89.5%)；攜帶甲氧芐啶耐藥基因(dfrA14)有18株(94.7%)；β-內酰胺酶耐藥基因為blaLAP-2、blaTEM-1B、blaKPC-2、blaSHV-12、blaSHV-15和blaSHV-66，同時攜帶此6種耐藥基因的菌株有15株(78.9%)。

3 討論

KP是院內感染的常見致病菌之一，易造成創面、肺部、泌尿系統和血液系統感染[7]。本研究期間，本院KP的分離率呈逐年上升趨勢(χ2趨勢=18.190，P＜0.001)，差異有統計學意義(χ2=26.800，P＜0.001)。2416株KP有51.7%分離自痰液，表明KP主要感染部位為呼吸道，與其他監測報道一致[8-10]。KP主要分布于ICU、呼吸內科，可能由于住院患者病情危重且抵抗力低下，接受呼吸道侵入性治療多，抗菌藥物的使用較為頻繁[11]，易誘導引起細菌耐藥。

本研究中，由于近幾年臨床廣泛使用抗生素，KP的耐藥率總體呈升高趨勢。耐藥率較高的抗生素有頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南、慶大霉素、環丙沙星、復方磺胺甲惡唑，結果顯示KP對頭孢菌素的耐藥率呈逐年攀升趨勢。對碳青霉烯類藥物(如亞胺培南、美羅培南)的耐藥率相比較低，但有持續增高的趨勢[12]，對亞胺培南、美羅培南耐藥率分別從2015年的2.9%、3.0%上升至2019年的16.0%、13.7%，2019年CHINET中國細菌耐藥監測結果報道，36所三級醫院的KP對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%、2.9%增至2019年的25.3%、26.8%[13]，耐藥率高于本研究結果。提示臨床應強化碳青霉烯類藥物的管理，防止藥物對多重耐藥菌及泛耐藥菌的選擇。本研究中KP對常用抗生素的耐藥率偏高，未發現替加環素耐藥的KP，其原因與KPC能夠水解青霉素類、β-內酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類等抗菌藥物有關[8]。

近年來，CR-KP呈現全球蔓延趨勢，引起了國內外的廣泛關注[14]。本研究顯示2015—2019年本院的CR-KP的檢出率呈上升趨勢(χ2趨勢=46.176，P＜0.001)，差異有統計學意義(χ2=63.973，P＜0.001)。標本主要來源于痰液(43.8%)，表明CR-KP的感染部位以呼吸系統居多，與Li等[15]的報道一致。分布科室主要集中于ICU，考慮與ICU患者常接受侵入性操作(如氣管插管、呼吸機輔助通氣)、氣道黏膜屏障易受損等因素相關，提示臨床和感控部門應加強重點部位三管的感染防控管理，以降低呼吸道CR-KP的感染率。

碳青霉烯類抗菌藥物是耐藥腸桿菌科細菌治療的最后一道防線[16]，CR-KP的檢出率和耐藥率逐年增高，給臨床抗感染治療帶來了巨大挑戰。引起這種結果的主要原因為臨床抗菌藥物濫用、患者使用抗菌藥物時未遵照醫囑執行，以及抗生素在農牧業中的超量使用等[17]。目前，我國臨床針對CRE的有效用藥為替加環素、多黏菌素，也可同其他種類抗生素聯合使用[18]。本研究結果顯示，2015—2019年CR-KP對各類抗菌藥物的耐藥率總體呈升高趨勢，除慶大霉素、替加環素以外，其對各類藥物不同年份間的耐藥率差異均有統計學意義(P＜0.05)。CR-KP除了對替加環素的耐藥率較低以外，對絕大部分抗菌藥物的耐藥率均偏高，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達100%和98.8%。提示臨床應重視抗菌藥物使用的科學化管理，改善抗菌藥物應用策略，重點關注替加環素、碳青霉烯類等抗菌藥物使用的監督管理。

CR-KP耐藥機制較為復雜，主要有產碳青霉烯酶、高產AmpC酶、外膜孔蛋白的缺失或低通透性、外排泵的過表達、藥物作用位點的改變等分子生物學機制導致[19]。其中，產碳青霉烯酶最為重要。A、B、D類β-內酰胺酶為產碳青霉烯酶的主要分類，主要為KPC、VIM、IMP、NDM、OXA-48[20]。位于質粒上的耐藥基因可在不同菌株間水平或垂直傳播，引起耐藥菌的播散，甚至是院感暴發的發生[21]。細菌耐藥性研究主要包括耐藥表型和耐藥基因型研究。耐藥表型常用藥敏試驗檢測，但常局限于藥物種類的不全面和少數菌株培養的嚴格環境；聚合酶鏈反應(PCR)為目前主要的基因研究方法，但僅局限于已知的基因型，分辨率較低[22]。隨著測序技術的快速發展，WGS與生物信息學結合的方法已逐漸成為精準研究細菌耐藥性的主流方法[23]。

本研究選取CR-KP檢出率較高的內科ICU，收集其2019年檢出的19株CR-KP進行WGS及耐藥基因檢測。結果顯示，19株CR-KP呈現出多種耐藥基因型。其中，blaKPC-2是引起耐碳青霉烯的重要機制，已廣泛存在于19株CR-KP中，其他β-內酰胺酶耐藥基因可能導致頭孢菌素耐藥。本研究中的菌株均攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrS1)，Qnr蛋白是一種五肽重復蛋白家族，可以保護細菌DNA螺旋酶和拓撲異構酶IV免受喹諾酮類藥物的抑制，qnrS1是質粒介導的7大qnr耐藥基因家族之一，Monarrez等[24]報道證實環丙沙星可誘導細菌質粒上qnrS1的表達。17株CR-KP攜帶的aadA2b和aadA2b是aadA耐藥基因中最常見的一種類型[25]，aadA基因最初于1985年發現，有研究表明Ⅰ類整合素中存在aadA基因，該基因編碼氨基糖苷3'-9-腺苷酸轉移酶，對鏈霉素和壯觀霉素具有抗性[26]。rmtB耐藥基因位于質粒上，其通過水平轉移和克隆傳播進行傳播[27]，rmtB通過促進16S RMTA酶編碼基因的激活和轉移，實現16S RMTA酶誘導細菌對氨基糖苷類的高水平耐藥，影響了氨基糖苷類藥物在CR-KP感染治療中的作用[28]，本研究中的19株CR-KP均攜帶rmtB基因。本研究中的藥敏試驗未檢測磷霉素，WGS耐藥基因檢測到19株CR-KP均攜帶磷霉素耐藥基因(fosA)，磷霉素可能對于CR-KP的治療無效。本研究中CR-KP對替加環素均敏感，其攜帶的四環素耐藥基因均為tetA，屬于MFS型外排泵，此型不產生替加環素耐藥。本研究未檢測出多黏菌素耐藥基因。同時，本研究中的耐藥基因結果顯示，19株CR-KP的同源相關性較高，說明CR-KP在該病區存在院內傳播的可能，但由于檢測菌株數目較少、代表性不強，在預測院內傳播路徑方面的研究仍具有一定的局限性。

綜上所述，近年來本院KP及CR-KP耐藥形勢嚴峻，耐藥基因多樣化，醫務部、醫院感染管理辦公室、藥學部、感染性疾病科、微生物室、醫學信息科等多學科抗菌藥物管理組，應持續加強耐藥菌監測，規范管理抗菌藥物，有效開展抗菌藥物知識培訓，落實精準的感染預防控制措施，預防耐藥菌的流行播散。 WGS結合生物信息學分析技術在細菌耐藥性研究方面表現出較好的應用前景[29]，未來將會成為耐藥菌研究最主流的方法之一。