氨芐西林和安普霉素對禽源沙門菌的體外聯合效果和耐藥突變選擇窗的研究

張靖菊 徐飛 劉靜 陳晨 張向陽 李秀波

(國家飼料藥物基準試驗室，中國農業科學院飼料研究所，北京 100081)

沙門菌是一種人畜共患病原菌，給國內肉雞養殖業帶來巨大經濟損失，又因其在肉雞生產鏈上的持續存而威脅人類的食品安全。目前禽場預防沙門菌病用抗菌藥，但亂用濫用現象嚴重，導致新抗菌藥研發的速度遠不及細菌發生耐藥突變的速度，甚至禽場產生的超級耐藥菌順著生產鏈傳播給人類，造成無藥可醫的嚴峻局面。為放慢細菌不斷獲得新耐藥基因的步伐，響應國家提倡的獸用抗菌藥減量行動，一些專業人員提出老藥新用的新思路，其中一種方法就是選擇一些早期研發的經典抗菌藥進行聯合，提高藥效，降低用量，延緩突變。氨芐西林(Ampicillin，AMP)是Ⅰ類細菌繁殖期殺菌劑，屬于非限制使用級別抗菌藥，主要作用于細胞壁，干擾肽聚糖的合成，在畜禽細菌病防治中應用廣泛，但其對β-內酰胺酶不穩定,細菌易產生耐藥性。安普霉素(Apramycin，APR)是Ⅱ類靜止期殺菌劑，屬于氨基糖苷類藥物，也是動物專用抗生素，其抑菌原理有二，一是作用于核糖體30S亞基，干擾蛋白質的正常合成；二是使細胞膜通透性增加，導致胞內離子、酶類等重要的物質丟失，最終引起菌體死亡[1]。理論上，這兩種藥物聯用會產生不錯的協同效應，但相關基礎性試驗研究尚未見發表，其聯用的合理性有待被證明。

防耐藥突變濃度(mutation preventive concentration，MPC)和耐藥突變選擇窗(mutant selection window,MSW)是Drlica等[2]提出的有關耐藥突變的新理論。MPC是指防止耐藥性突變菌株增殖所需的最低濃度，MPC理論認為當藥物濃度大于MIC時，大量敏感菌被殺滅，少量細菌會因耐藥突變而被選擇性增殖。MSW是指MIC～MPC之間的抗菌藥濃度范圍，MSW理論打破了傳統的MIC理論(即用藥濃度低于MIC時更易誘導細菌產生耐藥突變)，認為抗菌藥濃度在MSW范圍內細菌才會發生耐藥突變，該理論已得到諸多體內體外試驗的驗證。因此臨床用藥時最好越過MSW，更能避免耐藥突變株的產生，但許多抗菌藥的MSW過大，輕易越過可能會導致動物機體中毒甚至死亡。María等[3]曾對野生型銅綠假單胞菌進行磷霉素與妥布霉素的聯合用藥研究，發現這兩種作用機制不同的藥物可以互相關閉部分不耐藥菌株的MSW。Xu等[4]也通過3種藥物組合對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)聯合作用和MSW的研究發現，有協同效果且作用機制不同的聯合用藥組合能顯著縮小甚至關閉藥物的MSW。根據MPC理論，細菌發生一次耐藥突變的概率為10-6～10-10，同時發生兩次突變的概率為10-12～10-16(可視為不發生)，所以細菌在兩種不同作用機制的藥物作用下想要存活就必須同時發生兩次耐藥突變，這就大大降低了突變發生的概率。近年來，養殖業關于沙門菌對AMP耐藥的報導繁多[5-8]，有理由推測AMP的臨床用藥濃度可能落在了MSW范圍內，本研究在進行AMP和APR對禽源沙門菌的體外聯用效果評價的同時，也探索了AMP和APR聯用能否縮小甚至關閉AMP對沙門菌的MSW，達到預防和延緩耐藥的效果，以期為尋找合理的抗菌藥物減量、增效和預防耐藥配方提供科學依據。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

標準質控菌株大腸埃希菌ATCC25922購自美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)；22株禽源沙門菌均源自中國農業科學院飼料研究所國家飼料藥物基準試驗室菌庫(2018年自山東、北京地區采集)。

1.1.2 培養基

MH營養瓊脂、MH營養肉湯、沙門菌鑒別培養基XLT4瓊脂購自青島海博生物公司。

1.1.3 藥品和儀器

氨芐西林(AMP)和安普霉素(APR)購自北京博普欣公司。

1.2 方法

1.2.1 單藥MIC測定-微量肉湯稀釋法

參照2017年CLSI發布的M100s第27版[9]推薦的操作方法及判定標準(表1)，以大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株，使用微量肉湯稀釋法分別檢測AMP和APR對22株臨床沙門菌的最小抑菌濃度(MIC)。在96孔無菌微孔板上采用倍比稀釋法用生理鹽水將濃度為5120 μg/mL的抗菌藥母液稀釋至合適的梯度范圍，每孔為100 μL藥液+100 μL濃度為105CFU/mL左右的菌懸液，陰性對照為無菌有藥孔，陽性對照為有菌無藥孔。AMP的終濃度范圍為1/8～64 μg/mL，APR的終濃度范圍為1～128 μg/mL。整板置于37℃恒溫培養箱孵育16～20 h觀察結果。

表1 藥敏試驗判斷標準Tab.1 Determination criteria of drug sensitivity test

1.2.2 聯合藥敏試驗-微量肉湯棋盤稀釋法

在兩藥單藥MIC結果的基礎上設計聯合棋盤，棋盤規格為8×8，其中每種藥物的終濃度梯度為4MIC、2MIC、1MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC(X MIC表示X倍的原單藥MIC)。用生理鹽水將抗菌藥母液稀釋至所需濃度的抗菌藥工作液，隨后在96孔板每孔中加入兩種抗菌藥液各50 μL和5.0×105CFU/mL的沙門菌菌懸液100 μL，共計200 μL，以不加菌的純肉湯和藥液作為陰性對照，整板置于37℃溫箱培養16～20 h觀察結果，記錄AMP聯用時的MIC值和APR聯用時的MIC值。

以部分抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index，FICI)作為聯合藥敏試驗結果的判斷依據。FICI=MICAMP聯合/MICAMP單獨+MICAPR聯合/MICAPR單獨。FICI≤0.5為協同作用，0.5＜FICI≤1為相加作用，1＜FICI≤2為無關作用，FICI＞2為拮抗作用[10]。

1.2.3 殺菌動力學試驗-試管法

取臨床菌株BJH8C002(北京某生鮮超市，S.typhimurium)和BJH8P020(北京某生鮮超市，S.thompson)進行殺菌動力學試驗。根據菌株微量肉湯稀釋法和棋盤法結果將試驗分為4組：①1MIC濃度的AMP+菌液；②1MIC濃度的APR+菌液；③1/2MIC的AMP+1/2MIC的APR+菌液；④菌液+生理鹽水。(96孔板和試管同時進行，設兩組平行：96孔板每孔加100 μL所需濃度藥液(兩藥聯用時各藥50 μL)和5.0×105CFU/mL菌液100 μL，并用酶標儀進行持續地動力學監測；試管中則加入1 mL 5.0×105CFU/mL菌液和1 mL藥液并置于36℃±1℃恒溫搖床孵育，在1、2、3、4、6、8、10和20 h取每組菌液進行菌落計數。以菌落對數值為縱坐標，時間為橫坐標繪制時間-殺菌曲線。

判斷標準[11]：觀察在孵育的過程中是否在某一或某些時間點出現聯合用藥菌落計數對數值較最有效的單藥組減少≥2 lgCFU/mL的情況，可定義為協同；2 lgCFU/mL＞減少量＞1 lgCFU/mL，可定義為相加；減少量≤1 lgCFU/mL時定義為無關；聯合后增加量≥2 lgCFU/mL時定義為拮抗[12]。

1.2.4 不同加藥順序試驗-微量肉湯棋盤稀釋法

以1.2.2的聯合藥敏試驗為同時加藥聯合組，另選擇6株臨床沙門菌以及標準質控菌ATCC25922為試驗對象，進行AMP和APR不同加藥順序的聯合藥敏研究，分為①先AMP：先加AMP和菌液，孵育2h后再加APR；②先APR：先加APR和菌液，孵育2h后再加AMP。其余部分和同時藥敏試驗一致，計算FICI，并與同時聯合藥敏的FICI進行比較。

1.2.5 AMP對臨床沙門菌防耐藥突變濃度(MPC)的測定

(1)菌懸液制備 取過夜培養的沙門菌單菌落接種于20 mL MH肉湯中，37℃振蕩過夜培養，離心后重懸于200 mL MH肉湯再振蕩培養4～6 h，菌液濃度可達約6×109CFU/mL，6000 r/min離心后富集，用生理鹽水將菌液濃度調至4×1010CFU/mL。

(2)AMP單藥的MPC值測定 用倍比稀釋法配制含AMP的MH瓊脂培養基，2 mL不同濃度的藥液與18 mL滅菌MH瓊脂混勻制成藥物濃度分別為1、2、……、128、256 μg/mL的單藥MH瓊脂培養基。取100μL菌懸液均勻涂布于每個加藥培養基上，每株菌每個濃度3個平板，以保證每株菌每個濃度的總接種量＞1010CFU/mL；37℃恒溫培養，觀察并記錄24、48和72h的細菌生長情況，以72h無菌落生長的最低藥物濃度為初測MPC值(provisional MPC，MPCpr)。以MPCpr為基準，線性遞減10%～20%AMP的濃度，配制濃度范圍為MPCpr～1/2MPCpr的含藥平板，以上述方法測定72 h無菌生長的最低藥物濃度，即為精確的MPC值。

(3)AMP與APR聯用的MPC值測定 兩藥聯用時，含藥MH瓊脂板中APR的終濃度為其對應每株菌的MIC；AMP則以2倍稀釋法從每株菌的1/16MIC稀釋到MPC。兩種藥各1 mL，與18 mL的MH瓊脂均勻混合配制成不同濃度配比組合的含藥培養基，每株菌每個濃度配制3個培養基，用與“1.2.5(2)”項下相同的方法測定AMP+APR聯合用藥時的MPC。

(4)SI的計算和MSW的判定 根據AMP單用及AMP+APR聯用對臨床沙門菌的MIC、MPC值計算SI和MSW，SI=MPC/MIC[13]，且SI≥1有效，MSW為單藥和聯合各自MIC至MPC之間的范圍。

1.2.6 統計學分析方法

使用IBM SPSS Statistics 25對結果進行Shapiro-Wilk檢驗、Wilcoxon符號秩和檢驗及配對t檢驗等統計學分析。

2 結果

2.1 單藥和聯合藥敏試驗結果

表2顯示：對AMP和APR聯用對22株臨床沙門菌的FICI為0.375～1，表現為協同和相加效果；對表2中兩藥的單藥藥敏試驗組和聯合藥敏試驗組進行配對樣本的Wilcoxon符號秩和檢驗，P＜0.05，有顯著性差異。圖1顯示：兩藥聯合的協同率為43.48%，相加率為56.52%，聯合效果較好。

表2 AMP和APR聯合藥敏試驗結果Tab.2 The results of the combined drug sensitivity test of AMP and APR

2.2 時間-殺菌曲線

圖2顯示：隨著用藥時間的增加，第4小時2株菌的聯合用藥菌落計數對數值較最有效的單藥組分別減少了3.10和1.94 lgCFU/mL，前者表現為協同作用，后者表現為近似協同的相加作用。

2.3 不同加藥順序聯合作用結果

將表3中的3個試驗組兩兩配對進行配對t檢驗，結果均為P＞0.05，無顯著性差異，因此加藥順序的不同對兩種藥物的聯合效果無影響。

表3 加藥順序不同的聯合藥敏試驗的FIC值Tab.3 FIC value of combined drug sensitivity test with different dosing order

2.4 AMP對臨床菌的MPC測定結果

表4顯示：AMP和APR聯用使得AMP的防耐藥突變濃度顯著降低，SI值降低為原來的7.7%～40.0%。圖3直觀的表現出AMP和APR聯用使得AMP對沙門菌的耐藥突變選擇窗范圍顯著縮小。

表4 AMP單用以及和APR聯用的MPC值和SI值Tab.4 MPC and SI values of AMP alone and in combination with APR

3 討論

3.1 AMP和APR聯合

繁殖期殺菌劑AMP和靜止期殺菌劑APR是禽場治療和預防沙門菌病的常用藥物，其聯合優勢在于兩種抗菌藥物的作用機制不同，多數情況下繁殖期殺菌劑作用于細胞壁，靜止期殺菌劑作用于細胞壁內，聯用時繁殖期殺菌劑破壞細胞壁可輔助靜止期殺菌劑進入細菌細胞內發揮作用，因此常會出現相加和協同效應[14]。王新等[15]測定了APR與AMP聯用對金黃色葡萄球菌的體外抗生素后效應(PAE)，結果表明，APR與AMP聯用對金黃色葡萄球菌的體外PAE呈現相加或協同作用。一般來說，革蘭陰性菌的細胞壁肽聚糖(繁殖期殺菌劑的靶點)含量遠少于革蘭陽性菌，因此很多學者認為繁殖期殺菌劑和靜止期殺菌劑聯用對革蘭陰性菌并沒有協同作用[16-17]，但本研究對22株沙門菌進行AMP和APR聯合藥敏試驗，發現有明顯的協同和相加效果，說明聯合效果較好。為獲得更全面的AMP和APR兩藥聯合使用對臨床沙門菌的殺菌動力學信息，又對其中兩株沙門菌進行了殺菌動力學試驗，時間-殺菌曲線顯示出聯合組的殺菌速率明顯高于單獨用藥組，且至少表現出近似協同的相加作用。因此推測AMP和APR的聯合機制可能并不是或者并不僅僅是常見繁殖期和靜止期殺菌劑的協同機制，可能存在其他機制，有待進一步研究。

3.2 不同加藥順序

臨床上為了更好地發揮聯合藥效，需考慮到兩藥的半衰期、抗菌機制等，從而安排合理的給藥順序。細菌在繁殖期需要大量合成以供分裂的細胞壁，先在繁殖期加入繁殖期殺菌劑破壞細胞壁更有利于后加入的靜止期殺菌劑發揮作用，承曉京等[18]進行了阿奇霉素與頭孢噻肟對大腸埃希菌的不同加藥順序的聯合研究，發現先使用頭孢噻肟(繁殖期殺菌劑)或同時給藥的體外聯合效果更好。因此本研究參照時間-殺菌曲線殺菌動力學結果對AMP和APR進行不同加藥順序的聯合。考慮到AMP和APR在雞體內的半衰期均為2 h左右[19]，選用的前后加藥間隔時間為2 h，并比較其組間差異。結果表明不同加藥順序對沙門菌的殺菌效果無明顯差異，這與預期結果出入較大，同時也從側面反映了在“3.1”中的猜想，即可能存在非常規的協同機制。

3.3 縮小耐藥突變選擇窗

AMP是時間依賴型抗菌藥(即藥物效果與其在體內達到殺菌效果濃度的時間長短有關)，耐藥突變窗理論對其十分適用，因此本研究測定了AMP對10株臨床菌的MSW，范圍為8～13 μg/mL不等。劉志亮等[19]對10%氨芐西林混懸液在雞體內的藥動學及生物利用度進行了研究，結果表明，10%氨芐西林的絕對生物利用度為35.27%，而禽場臨床使用的氨芐西林可溶性粉的給藥劑量為35～50 μg/mL，對比本次實驗結果可以看出，臨床用藥時雞體內血藥濃度落在MSW的可能性很大，這也與AMP耐藥突變株增多的報道逐年增加相對應[20-22]。接著測定了MIC濃度的APR與AMP聯用的MPC，結果發現僅MIC濃度的APR就能顯著縮小甚至關閉AMP對禽源沙門菌的的MSW。可見APR和AMP聯用不僅能增加抗菌效果，還能通過增加菌株的選擇性壓力而預防和延緩耐藥。

3.4 小結

總體而言，本研究證明了AMP和APR聯合用藥對禽源沙門菌有顯著的相加和協同效果，不同的用藥順序對聯合效果無影響，并且能顯著縮小AMP對沙門菌的MSW范圍，同時也對AMP和APR的協同機制提出一些猜想。這些初步探索可作為進一步研究AMP和APR體內聯合用藥時PK/PD模型的理論依據，為最終研制出既減少抗菌藥用量又延緩耐藥的復方制劑提供宏觀研究基礎。