三維石墨烯固相萃取液相色譜法測定結晶紫含量

黃寶美，張 梅，吳嘉欣，王 茂

(綿陽師范學院化學與化學工程學院，四川綿陽 621000)

0 引言

結晶紫是三苯甲烷染料中的一種，因其成本低、效率高而被廣泛應用于水缸魚和魚卵中的外源真菌和寄生蟲的控制[1].現代醫學研究表明非法使用結晶紫會影響人體免疫系統和生殖系統.目前，歐盟、美國、中國等許多國家都要求在水產養殖中限量使用結晶紫[2].因此，建立一種檢測水產品中結晶紫的高靈敏度的測定方法具有重要意義.

目前測定結晶紫的方法主要有：高效液相色譜[3]、氣相色譜-質譜(GC-MS)[4]和毛細管電泳(CE)[5]等.其中靈敏度高、線性范圍寬的高效液相色譜法是測定結晶紫最常用的方法.由于水產品中成分復雜，基質干擾物多，因此必須在分析檢測前選擇合適的樣品前處理技術以分離富集樣品中的目標化合物，如固相萃取[6]、磁萃取[7]、液-液微萃取(LLME)[8]和冷誘導聚集微萃取(CIAME)[9]等.

三維石墨烯(3D-GN)是碳納米材料的胞狀晶格結構，具有較大的石墨層平面，獨特的二維結構和孔徑分布.其比表面積可高達2 630 m2/g，具有良好的化學穩定性、機械性能和非常高的吸附能力，是最有潛力的吸附材料之一，在水吸附和凈化處理方面具有良好的應用前景[10]，能更有效地去除水污染物中的結晶紫.本文以3D-GN為固相萃取劑，利用高效液相色譜-固相萃取聯用技術對魚樣中結晶紫殘留量的檢測進行了研究，該方法原理簡單，測定速度快，方便操作，為大規模檢測提供方法參考.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津科技有限公司)，包括LC-20AT型高壓雙泵、SIL-20A自動進樣閥、SPD-20AT紫外-可見檢測器、CTO-20A柱箱、LCsolution色譜數據工作站和IBM臺式電腦；JSM-6460F掃描電子顯微鏡(SEM)(日本電子株式會社)；透射電子顯微鏡(TEM)(德國布魯克公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(美國布魯克儀器公司).

結晶紫(天津凱密化學試劑有限公司);純度大于99.85%的石墨粉(上海華誼集團公司).所有其他化學品均為分析試劑級.實驗用水為純水.本實驗是在室溫下進行的.

1.2 高效液相色譜條件

C18色譜柱柱(粒徑5 μm，內徑250 mm×4.6 mm)；流速為0.5 mL·min-1，注射量為10 μL；流動相為乙酸銨(溶劑B)和乙腈(溶劑A，pH=4.5)；A/B比值保持在20/80(v/v)；結晶紫檢測波長為588 nm.

1.3 3D-GN的制備

1.3.1 氧化石墨烯(GO)的制備 根據改進的Hummers制備GO[11].具體步驟如下：冰水浴條件下，將1 g片狀石墨粉和1 g NaNO3粉加入裝有70 mL H2SO4的三頸反應瓶中.在磁力攪拌器的作用下，緩慢加入6 g KMnO4粉末(T≈5 ℃)，控制反應溫度反應2 h.冰水浴變為溫水浴時，保持溫度35 ℃下，接下來將100 mL二次蒸餾水緩慢多次加入，并控制溫度在100 ℃以下，保持30 min，加入5 mL 30%的H2O2除去未反應的KMnO4，45 min后，再加入60 mL二次蒸餾水，反應10 min.溶液顏色變為亮黃色時趁熱過濾，用10%稀鹽酸和二次蒸餾水洗滌.將超聲分散6 h后的下層沉淀液在轉速3 000 r·min-1離心30 min，下層膠液在10 000 r·min-1離心40 min.最后將下層膠液在50 ℃真空干燥箱中充分干燥2-3天，得到GO產品.

1.3.2 3D-GN的制備 稱取100 mg GO，分散在200 mL水溶液中.取0.5 g·L-1的棕黃溶液，用超聲波清洗機清洗1 h，得到穩定的分散懸液.將所得懸浮液放入80 ℃的溫水浴中.然后準確稱取1.0 g硼氫化鈉，溶解于蒸餾水中，滴入反應體系.將反應1 h的還原產物在60 ℃的真空干燥箱中沉淀，得到3D-GN樣品.

1.4 魚樣的處理

校園街市購買的魚樣處理搗碎.稱取該魚樣10.00 g加入裝有3 mL鹽酸羥胺溶液，5 mL對甲苯磺酸溶液和10 mL醋酸緩沖液的100 mL燒杯中，轉入勻漿器加10.00 mL乙腈攪拌1 min，再加入酸性10 g Al2O3攪拌1 min.然后將該溶液在轉速3 000 r·min-1下離心10 min.最后把離心液轉移到含有4 mL二甘醇，20 mL水和20 mL乙腈的100 mL加塞的離心管.接下來對魚樣進行凈化處理，將30 mL二氯甲烷在3 000 r·min-1的速度下離心10 min，2次.收集離心液于50 ℃加熱蒸發至干燥，用2.5 mL乙腈溶解，再次蒸發至接近干燥，以1 mL流動相準確溶解殘液，將殘液過0.45 μm濾膜后用高效液相色譜法測定[12].

1.5 3D-GN用于結晶紫的富集流程

分別量取50 mL空白魚樣品(經1.4處理后未加石墨烯的魚樣品)和標準魚樣品溶液(在空白魚樣品中加入結晶紫標準溶液至結晶紫濃度為1.5 μg·mL-1)，各裝入100 mL錐形瓶中并調節pH=7，并將兩個錐形瓶內的溶液都進行如下操作.即向錐形瓶加入60 mg 3D-GN，再加入1 mL丙酮振蕩分析5 min，然后保持30 ℃恒溫振動吸收3 h，重復3次.將錐形瓶所得的洗脫液合并，蒸發至接近干燥，用1 mL流動相溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾.最后取10 μL濾液進行高效液相色譜分析.

2 結果與討論

2.1 3D-GN的表征

2.1.1 TEM和SEM表征 圖1(a)(b)為GO的TEM和SEM圖，(c)(d)為3D-GN不同放大倍數下的SEM圖.從圖1(a)(b)可以看到，GO表面光滑透明，狀態蓬松，有褶皺、卷曲和團聚現象.由(c)(d)可以看出，3D-GN樣品透明，出現褶皺狀起伏，卷曲度較大.

圖1 GO的TEM圖(a)；GO的3000倍SEM圖(b)；3D-GN的5000倍SEM圖(c)；3D-GN的30000倍的SEM圖(d)Fig.1 The TEM diagram of GO(a);The SEM diagram of3000 times of GO(b);The SEM diagram of 5000 times of3D-GN(c);The SEM diagram of 30000 times of 3D-GN(d)

2.1.2 紅外光譜表征 GO和3D-GN的紅外光譜如圖2所示.A為GO的紅外光譜，從圖中曲線可知，1 392 cm-1，3 450 cm-1處為O-H(羥基)的面內變形振動特征峰和變形膨脹振動吸收峰，1 724 cm-1為C=O(羰基)的伸縮振動吸收峰，1 052 cm-1和1 221 cm-1分別代表GO的C-O-C烷氧基和烷基代表的振動吸收峰，1 620 cm-1處說明GO的C=C的拉伸振動特征峰較羰基弱.上述結果表明本實驗制備的GO至少含有羥基、烷基、羰基、烷氧基和C=C官能團.3D-GN的紅外光譜如B所示，1 700 cm-1處的吸收峰屬于氧官能團C=O的伸縮振動.同時環氧C-O(約1 200 cm-1)和烷氧基C-O(約1 000 cm-1)的伸縮振動峰明顯減少，而C=C的吸收明顯，說明實驗制備的3D-GN產品性能良好.

圖2 GO和3D-GN的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR of GO and 3D-GN

2.2 色譜分析及標準曲線 本實驗魚樣品未檢測出CV

在最優實驗條件下，1.5 μg·mL-1結晶紫標準液的色譜圖見圖3(A)，添加1.5 μg·mL-1標準結晶紫的魚樣(B)，魚樣B經3D-GN富集的色譜圖(C),(D)為結晶紫溶液定量分析標準曲線.

圖3 1.5 μg·mL-1結晶紫標準工作液下的液相色譜圖(A)；添加1.50 μg·mL-1結晶紫標準溶液后的魚樣的色譜圖(B);添加1.50 μg·mL-1結晶紫標準溶液的魚樣經3D-GN富集后的色譜圖(C)；結晶紫溶液定量分析標準曲線(D)；Fig.3 The chromatogram of standard CV working solutionat 1.5 μg·mL-1；The chromatogram offish sample added with 1.50 μg·mL-1 standard CV(B);The chromatogram of fish sample added with 1.50 μg·mL-1standard CV after enrichment with 3D-GN(C); Calibration curve for quantitative analysis of CV(D);

從圖3(B)中可以看出，加標魚樣品(在空白魚樣品中加入結晶紫標準溶液至結晶紫濃度為1.5 μg·mL-1)峰高為20 mAu.而添加1.50 μg·mL-1標準結晶紫的魚樣品經3D-GN富集后的結晶紫峰高達1 280 mAu，如圖3(C)所示.計算可得，3D-GN富集倍數為64，說明樣品經富集后能大大提高結晶紫檢測的靈敏度.

按試驗方法對0.015，0.01，0.05，1.0，5.0，10，30和50 μg·mL-1的結晶紫溶液在色譜條件下進行測定，定量分析標準曲線見圖3(D).根據實驗結果分析，結晶紫濃度(x)在0.015～50 μg·mL-1范圍內與其峰高呈良好線性關系(R2=0.999 0)，線性回歸方程為y=42.04x-9.167，檢出限為5×10-5μg·mL-1.

查找文獻對比本文方法與其他不同前處理方法在檢出限、采用的色譜柱以及回收率三方面對比，結果如表1所示.

表1 本文的方法與其他前處理方法測定CV的檢出限比較Tab.1 Comparison of the LODs of the present method with otherpretreatment methods for HPLC determination of CV

2.3 方法回收率和重現性

取空白魚樣品若干份，分別加入濃度為1 μg·mL-1、2 μg·mL-1和5 μg·mL-1的標準溶液.按試驗方法平行測定，計算回收率和相對標準偏差，結果見表2.

通過實驗進行了穩定性和重現性的考察，連續測定6次，回收率在92%-97%之間，相對標準偏差(RSD)小于2%，說明該實驗測試穩定性良好.日內分析的相對標準偏差(RSD)為1.6%，日間分析的相對標準偏差(RSD)為2.1%，說明重現性良好.

3 結論

本實驗制備了3D-GN固相萃取劑，并建立了固相萃取-高效液相色譜法測定水產品中的痕量結晶紫的方法.該方法能準確高效快速檢測水產品中結晶紫的含量，操作簡便、高效且靈敏度較一般方法高，加標回收率以及重復性實驗符合分析要求，可為水產品中結晶紫痕量測定提供科學的方法.