彩葉礬根‘班納利音符’組培再生體系建立及快繁技術(shù)研究

韓素菊，張定珍

(綿陽(yáng)師范學(xué)院城鄉(xiāng)建設(shè)與規(guī)劃學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621000)

0 引言

礬根(Heucheramicrantha)是虎耳草科礬根屬植物，多年生耐寒常綠宿根彩葉草本花卉[1]，被譽(yù)為“花園的調(diào)色板”，屬于淺根性彩葉陰生地被植物，喜半蔭、耐全光、具有很好的耐寒性，能存活于-15 ℃的環(huán)境中，少數(shù)品種甚至能在-34 ℃低溫下存活，且礬根在富含腐殖質(zhì)、排水良好、肥沃的團(tuán)粒土壤中長(zhǎng)勢(shì)良好[2-3]，可快速形成景觀，集觀賞價(jià)值和生態(tài)修復(fù)功能于一體[4-5]，具有良好的市場(chǎng)和廣闊的開發(fā)利用前景.礬根品種繁多，但90%以上的品種都不易結(jié)籽，且種子細(xì)小不易播種成苗，不能用于商業(yè)批量化生產(chǎn)[6].多數(shù)礬根品種分孽性差，成活率不高[7]，想要短時(shí)間獲得大量?jī)?yōu)良新品種極其不現(xiàn)實(shí)，利用組培快繁技術(shù)能滿足市場(chǎng)對(duì)于礬根的大量需求.本試驗(yàn)利用‘班納利音符’礬根嫩葉為外植體，建立起了一套完善的礬根組培快繁體系，為國(guó)內(nèi)礬根類花卉工廠化育苗技術(shù)提供實(shí)踐指導(dǎo)技術(shù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從市場(chǎng)購(gòu)買生長(zhǎng)旺盛的成年‘班納利音符’礬根，栽種于學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，選取其幼嫩葉片作為外植體.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒處理 選取生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲害的礬根幼嫩葉片，先用70%酒精消毒，消毒時(shí)間為35、40、45 s，再用2%的次氯酸鈉溶液，消毒時(shí)間為5、7、9 min.消毒后將外植體切割成1 cm2左右的小塊接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基中MS+0.1 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA中.每瓶接入1個(gè)外植體，每個(gè)處理接種20瓶，接種30 d后統(tǒng)計(jì)不同處理時(shí)間對(duì)外植體污染率及誘導(dǎo)率的影響，篩選出最佳消毒時(shí)間，1周后觀察外植體的滅菌及生長(zhǎng)情況.

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 以MS為基本培養(yǎng)基，添加細(xì)胞分裂素類6-BA濃度為0.5、1.0、1.5 mg·L-1和生長(zhǎng)素類NAA濃度為0.4、0.5、0.6 mg·L-1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理.每瓶接入1個(gè)外植體，每個(gè)處理接種20瓶，觀察生長(zhǎng)情況、出愈時(shí)間及比例、愈傷組織形態(tài)，篩選出最適誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基.

1.2.3 叢生芽培養(yǎng)基的篩選 將各種類型的體胚在子葉剛剛展開時(shí)從愈傷組織上剝離出來(lái)，置于添加不同濃度6-BA和IAA的MS芽分化培養(yǎng)中.6-BA濃度為2.0、2.5、3.0 mg·L-1，IAA濃度為0.05、0.10、0.15 mg·L-1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶.觀察叢生芽的生長(zhǎng)發(fā)育狀況(出芽數(shù)的多少,分化苗的粗壯),篩選最適合誘導(dǎo)礬根愈傷組織分化為不定芽的最佳培養(yǎng)基.

1.2.4 增殖壯苗培養(yǎng)基的篩選 將不定芽分割為單芽，接種到添加有不同濃度的6-BA和NAA的MS為培養(yǎng)基上.6-BA的濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg·L-1，NAA的濃度分別為0.1、0.4、0.7 mg·L-1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共計(jì)9個(gè)處理.每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種4個(gè)芽.觀察生長(zhǎng)發(fā)育狀況，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，篩選最適合礬根不定芽增殖復(fù)壯的培養(yǎng)基.

1.2.5 生根培養(yǎng)基的篩選 將叢生芽切割成單芽，選取2 cm左右高的小苗接種到添加NAA濃度為0、0.1、0.2 mg·L-1，IBA濃度為0、0.5、1.0 mg·L-1的1/2MS培養(yǎng)基中，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，9個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶.接種30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、生根系數(shù)和平均根長(zhǎng)，觀察植株健壯程度，篩選最適合礬根生根的培養(yǎng)基組合.

以上培養(yǎng)基均添加6.8 g·L-1瓊脂，3%蔗糖，pH值為5.8～5.9，培養(yǎng)條件每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，溫度為(23±2)℃.

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Excel2007和SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析.

污染率=污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;

褐化率=褐化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;

死亡率=死亡的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;

成活率=存活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;

愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種后無(wú)菌成活的外植體數(shù)×100%;

不定芽分化率=分化出新芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù)×100%;

2 研究結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響

礬根作為一種多年生草本植物，但葉片嬌嫩，消毒時(shí)，需要在時(shí)間上控制更精確.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，消毒時(shí)間對(duì)外植體的污染率及出芽率產(chǎn)生的影響差異較大(見表1).礬根葉片的死亡率在每組實(shí)驗(yàn)中沒(méi)明顯變化，為5%～7%.但礬根的褐化率隨著消毒時(shí)間及消毒液濃度的逐漸增加也隨之增加，污染率隨著消毒時(shí)間及消毒液濃度的增加而降低.綜合考慮外植體的成活率、污染率和褐化率，選取75%乙醇消毒45 s，再用2%次氯酸鈉消毒7 min為礬根外植體的最適消毒方法，此時(shí)，外植體的成活率可達(dá)80.7%.

2.2 激素濃度對(duì)礬根葉片組培快繁的影響

2.2.1 激素濃度對(duì)礬根葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將礬根葉片平放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種7 d左右后，葉片開始卷曲，切口處開始有綠色小點(diǎn)逐漸膨大，20 d左右愈傷組織開始出現(xiàn)，大約40～50 d后愈傷組織在各種激素組合中都能完全形成，從葉片的出愈率及愈傷組顏色形態(tài)結(jié)果顯示，隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織玻璃化現(xiàn)象越嚴(yán)重，受生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度的影響很大(見表2).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在6-BA濃度為0.5 mg·L-1和NAA濃度為0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基上出愈率最高，達(dá)98.6%，且愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，質(zhì)量好，生長(zhǎng)速度快，為最適的培養(yǎng)基.

2.2.2 激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的影響 在表3中結(jié)果顯示，添加濃度為2.5 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的效果最好(見圖1E),不定芽的分化率可達(dá)87.2%，出芽數(shù)達(dá)16.5.不定芽的分化率隨著6-BA濃度的升高而增加，但當(dāng)濃度升高為3.0 mg·L-1的時(shí)候，愈傷組織分化率降低，且誘導(dǎo)出來(lái)的不定芽發(fā)生玻璃化(見圖1H)，且隨著NAA濃度升高至0.15 mg·L-1的時(shí)，愈傷組織變硬變脆，此時(shí)不再分化不定芽(見圖1I).適宜愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基是MS+6-BA2.5 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1.

圖1 激素對(duì)愈傷組織分化不定芽的影響Fig.1 Effects of Hormones on Indecent Bud of Callus Differentiation

2.2.3 激素濃度對(duì)礬根不定芽增殖壯苗的影響 將誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽接種至不同濃度激素組合的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗及增殖培養(yǎng).培養(yǎng)30 d后，觀察其增殖系數(shù)和生長(zhǎng)狀況.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見表4)，礬根不定芽增殖壯苗過(guò)程中對(duì)植物激素很敏感，較低濃度就可達(dá)到增殖復(fù)壯培養(yǎng)效果，而且增殖系數(shù)會(huì)隨植物生長(zhǎng)激素濃度的增高而增加,但是當(dāng)其上升到一定程度后其增值系數(shù)又開始降低，該實(shí)驗(yàn)中當(dāng)6-BA濃度升高到1.5 mg·L-1時(shí)增值速度開始下降，組培苗長(zhǎng)勢(shì)弱，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，見圖2L.當(dāng)6-BA、NAA濃度分別為0.5、0.7 mg·L-1時(shí)，此時(shí)不定芽增殖系數(shù)最高，但不定芽莖段脆弱，且部分苗略有玻璃化現(xiàn)象,如圖2J、K(此圖為圖C中苗的局部圖).最適礬根不定芽增殖壯苗的培養(yǎng)基是6-BA、NAA濃度分別為1.0 mg·L-1和0.1 mg·L-1,此時(shí)增殖速度快且苗生長(zhǎng)健壯，如圖2F.

圖2 激素對(duì)礬根組培苗增殖壯苗的影響Fig.2 Effects of Hormone on the Proliferation of Strong Seedling in Alum Root Tissue Culture

2.2.4 激素濃度對(duì)礬根不定芽生根的影響 由表5可知，在未添加植物激素的1/2MS培養(yǎng)基上，礬根試管苗都能生根，但根細(xì)較弱，數(shù)量少，如圖3A.在添加一定量的植物激素后，礬根組培苗生根的數(shù)量增加，當(dāng)IBA升高到1.0 mg·L-1時(shí)，根系發(fā)達(dá)且粗壯，如圖3中G，在處理3、4、6培養(yǎng)基中的生根率都可達(dá)到100%，但綜合組培苗的生根率、生根系數(shù)、平均根長(zhǎng)和生長(zhǎng)發(fā)育狀況，礬根不定芽最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS+IBA1.0 mg·L-1，生根率達(dá)100%，且植株健壯、根系發(fā)達(dá).

圖3 激素對(duì)礬根組培苗生根的影響Fig.3 Effect of Hormone on rooting of Alum Root Tissue Culture Seedling

3 結(jié)論

本研究采用礬根‘班納利音符’嫩葉為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織后再分化叢芽，培養(yǎng)再生植株.礬根葉片在MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上出愈率高達(dá)98.6%，愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，顏色純正，生長(zhǎng)速度快.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與侯非凡等[8]研究‘萊姆里基’愈傷組織誘導(dǎo)和趙玉琳等[9]研究礬根‘葡萄蘇打’產(chǎn)生愈傷組織相比，激素比例差異明顯，表明礬根不同品種和不同外植體愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基種類差異極大.

愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的質(zhì)量和數(shù)量取決于植物激素的類別和使用濃度[10].本研究中，6-BA濃度在2.0～3.0 mg·L-1范圍內(nèi)，不定芽的分化率隨著6-BA濃度的升高呈現(xiàn)先增加然后降低趨勢(shì)，2.5 mg·L-1便是臨界點(diǎn).當(dāng)6-BA濃度升高到3.0 mg·L-1時(shí)，NAA濃度為0.15 mg·L-1時(shí)，愈傷組織變硬變脆且不再分化不定芽，實(shí)驗(yàn)表明較高濃度的6-BA在礬根愈傷組織誘導(dǎo)不定芽過(guò)程中具有抑制作用.在實(shí)驗(yàn)中，愈傷組織誘導(dǎo)不定芽增值極易受激素的影響，低濃度激素便可產(chǎn)生較好的增殖效果，增殖系數(shù)會(huì)隨6-BA濃度的增高而增加，但當(dāng)6-BA濃度過(guò)高時(shí)，組培苗細(xì)弱，玻璃苗增多，苗在生根階段生根率極低，不易成活.本實(shí)驗(yàn)中最適合礬根‘班納利音符’由遇傷組織誘導(dǎo)不定芽增殖的培養(yǎng)基是MS+6-BA2.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1，誘導(dǎo)出來(lái)的芽多，且生長(zhǎng)健壯.

在礬根的各種生根培養(yǎng)研究中，研究結(jié)果差異很大.束曉春[11]等在礬根‘花毯’的研究中表示，各種生根培養(yǎng)基中，根長(zhǎng)、根數(shù)和生根時(shí)間差異不大，都能到達(dá)高生根率且保證根的健壯，孟清秀[12]研究最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.33 mg·L-1，章志紅等[13]研究報(bào)道表明1/2MS+NAA0.8 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1是最適宜礬根生根的培養(yǎng)基，但同時(shí)需添加較高濃度的活性炭.而在本研究中發(fā)現(xiàn)礬根叢芽生根很容易，且其根的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)添加生長(zhǎng)素極其敏感，IBA誘導(dǎo)生根的效應(yīng)比NAA的顯著，添加IBA對(duì)礬根組培苗的玻璃化現(xiàn)象有一定的抑制作用.礬根組培苗根系與葉柄交界處經(jīng)常易玻璃化，而IBA激素促進(jìn)該部位發(fā)生不定根，從而達(dá)到了降低玻璃化的現(xiàn)象，這與束曉春等[11]的研究結(jié)果一致.研究結(jié)果表明最適宜‘班納利音符’礬根生根培養(yǎng)基是1/2MS+IBA1.0 mg·L-1，生根率100%，且植株健壯、根系發(fā)達(dá).

本實(shí)驗(yàn)以‘班納利音符’礬根嫩葉為外植體進(jìn)行組培快繁研究，進(jìn)一步優(yōu)化了礬根組培快繁再生體系，為礬根的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化育苗提供借鑒和技術(shù)參考.