衢枳殼及其近緣種中四種黃酮苷類成分含量測(cè)定與相關(guān)性分析

葉雨濛 胡詩雨 徐象華 顏福花 秦路平 朱 波

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，其中衢枳殼為蕓香科植物胡柚Citrus maxima（Burm）Merr.的干燥未成熟果實(shí)，是浙江省道地藥材，新“浙八味”之一，性微寒，味苦、辛、酸，入肺、脾、大腸經(jīng)，具有理氣寬中、行滯消脹之功效，主治胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等癥[1]。現(xiàn)代化學(xué)與藥理學(xué)研究表明，枳殼中含有黃酮[2]、揮發(fā)油[3]和生物堿[4]等化學(xué)成分，具有抑菌[5]、降血脂[6]、抗抑郁[7]等藥理活性。目前，枳殼研究多集中在栽培技術(shù)、采收時(shí)間、干燥加工技術(shù)、炮制方法、藥理活性等方面[8-11]。而對(duì)衢枳殼及其近緣種中黃酮苷類成分含量測(cè)定的研究較少，本研究收集衢枳殼、成熟胡柚及其近緣種甌柑的種質(zhì)資源，建立高效液相色湘（HPLC）法測(cè)定上述樣品中四種黃酮苷類成分的含量，并分析其與經(jīng)緯度、海拔之間的相關(guān)性，以期為衢枳殼質(zhì)量評(píng)價(jià)及枳殼替代品的資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥 材 分別收集麗水老竹、麗水碧湖、衢州球川和衢州天馬四個(gè)產(chǎn)地的有籽甌柑、無籽甌柑、衢枳殼和胡柚。見表1。

表1 衢枳殼及其近緣種樣品信息

1.2 儀器與試劑 600-2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；FA2004 型電子分析天平（上海恒平精密電子儀器有限公司）；JP-180ST 型超聲波清洗機(jī)（深圳市結(jié)盟清洗設(shè)備有限公司）；XL-02A 型手提式粉碎機(jī)（杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司）；新橙皮苷（Y28F11Y16982）、橙皮苷（K09S11L123847）、柚皮苷（H24N9Z75896）、蕓香柚皮苷（P26J12L138815）對(duì)照品購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純（北京京科瑞達(dá)科技有限公司）；甲醇、磷酸等試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方 法

2.1 色譜條件 Waters Xbridge C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長283 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4 個(gè)對(duì)照品適量，精密稱定，置于不同10 mL 容量瓶中，加甲醇使之溶解并制成質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL 的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 分別取衢枳殼、胡柚、有籽甌柑、無籽甌柑樣品，粉碎，過3 號(hào)篩。取約2.0 g 樣品粉末，精密稱定，置于100 mL 圓底燒瓶中，加入50 mL 80%甲醇，固定于冷凝管上。70 ℃加熱回流1.5 h，抽濾，濃縮，用80%甲醇定容至100 mL 容量瓶，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 分別將“2.2.1”項(xiàng)下制備的四種對(duì)照品溶液用移液管精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mL 至不同10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，微孔濾膜過濾后取濾液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。

表2 線性關(guān)系考察

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 隨機(jī)取1 供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，記錄各成分保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算該樣品新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷峰面積RSD，測(cè)定該供試品溶液在24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性。

2.5 精密度試驗(yàn) 配制新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷的混標(biāo)溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，在“2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算對(duì)照品新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷峰面積RSD，測(cè)定儀器的精密度。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)取1 樣品粉末6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄各成分保留時(shí)間和峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各成分含量并計(jì)算RSD，測(cè)定該方法的重復(fù)性。

2.7 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的有籽甌柑樣品，精密稱取0.1 g，加入蕓香柚皮苷對(duì)照品0.2 mg，柚皮苷對(duì)照品0.3 mg，橙皮苷對(duì)照品0.5 mg；另精密稱取0.01 g 該樣品粉末，加入2 mg 新橙皮苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，平行6 次，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量并計(jì)算加樣回收率。

2.8 樣品含量測(cè)定 取衢枳殼、胡柚、有籽甌柑、無籽甌柑樣品粉末各約2.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再在“1.3.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，平行3 次，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 與EXCEL 2010 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，兩兩比較采用圖基檢驗(yàn)法（Tukey 法），以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC 方法建立 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測(cè)得有籽甌柑樣品新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷峰面積RSD 分別為0.6961%、0.0982%、0.1393%、0.4997%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)得對(duì)照品新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷峰面積RSD 分別為0.228%、0.353%、0.033%、0.110%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)得有籽甌柑樣品中新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷平均含量分別為249.2373 mg/g、4.7654 mg/g、3.1225 mg/g、1.9203 mg/g，RSD 分別為0.417%、0.606%、0.851%、0.307%，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收實(shí)驗(yàn)測(cè)得新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷的平均加樣回收率分別為99.51%、98.15%、100.35%、100.63%，RSD 分 別 為 1.22%、1.60%、2.09%、1.87%（見表3）。結(jié)果顯示，衢枳殼、成熟胡柚及其近緣種甌柑中的四種黃酮苷類成分在以80%甲醇為提取溶劑，70 ℃加熱回流1.5 h 的條件下可提取完全。在“Waters Xbridge C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水，體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長283 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL”的色譜條件下，出峰時(shí)間早，各色譜峰分離度好。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3.2 含量比較 衢枳殼、胡柚中橙皮苷的平均含量最低，分別為3.6461、2.7922 mg/g；有籽甌柑、無籽甌柑中蕓香柚皮苷的平均含量最低，分別為1.8617、1.9154 mg/g。從新橙皮苷的含量來看，有籽甌柑、無籽甌柑中的新橙皮苷含量顯著高于衢枳殼和胡柚，其中無籽甌柑的新橙皮苷含量最高，達(dá)291.0858 mg/g，分別是衢枳殼和胡柚的3.14、2.98 倍；衢枳殼、胡柚中的柚皮苷含量顯著大于有籽甌柑、無籽甌柑，其中衢枳殼中的柚皮苷含量分別是有籽甌柑、無籽甌柑的7.82、7.08 倍。

從蕓香柚皮苷、柚皮苷的含量來看，衢枳殼與胡柚、有籽甌柑、無籽甌柑之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），胡柚與有籽甌柑、無籽甌柑之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而有籽甌柑與無籽甌柑之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；從橙皮苷、新橙皮苷的含量來看，衢枳殼、胡柚和有籽甌柑、無籽甌柑之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

表4 衢枳殼及其近緣種中四種黃酮苷含量比較（n=3）

3.3 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，蕓香柚皮苷含量與緯度、海拔呈顯著正相關(guān)關(guān)系，其中與海拔的正相關(guān)系數(shù)最大，為0.9956，與經(jīng)度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；柚皮苷含量與緯度、海拔呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與經(jīng)度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，其負(fù)相關(guān)系數(shù)達(dá)-0.9964；橙皮苷、新橙皮苷含量與緯度、海拔呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與經(jīng)度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，見表5。

表5 四種黃酮苷含量與產(chǎn)地生境因子相關(guān)性分析

4 討論

黃酮苷類成分是中藥枳殼發(fā)揮理氣寬中、行滯消脹等藥理作用的重要活性成分，也是評(píng)價(jià)衢枳殼質(zhì)量的重要指標(biāo)性成分[12-13]。建立HPLC 法測(cè)定衢枳殼及其近緣種中黃酮苷類成分含量，對(duì)中藥衢枳殼的質(zhì)量控制及其近緣種中藥資源開發(fā)具有重要意義。同時(shí)，本試驗(yàn)還考察了不同提取方法（索式提取、加熱回流提取、超聲提取），加熱時(shí)間（30、60、90 min），提取溫度（60、70、80 ℃），流動(dòng)相（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.5%磷酸水）對(duì)衢枳殼、成熟胡柚及甌柑中四種黃酮苷類成分含量測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)以80%甲醇為提取劑，70 ℃下加熱回流提取1.5 h，即可提取完全，該方法可用于衢枳殼藥材質(zhì)量控制及其近緣種中黃酮苷類成分的含量測(cè)定。

柚皮苷與新橙皮苷是2020 年版《中國藥典》中枳殼的含量測(cè)定指標(biāo)性成分[1]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，成熟胡柚新橙皮苷含量高于衢枳殼，但柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷含量均低于衢枳殼，從含量測(cè)定角度看，我們認(rèn)為成熟胡柚不適合作為衢枳殼的替代品。試驗(yàn)從化學(xué)成分的角度論證了枳殼的采收時(shí)期應(yīng)以未成熟果實(shí)為佳。此外，雖然有籽甌柑與無籽甌柑中柚皮苷含量低于衢枳殼，但新橙皮苷含量是衢枳殼的2.80～3.14 倍，有望進(jìn)一步通過藥效學(xué)評(píng)價(jià)，將甌柑的外果皮作為衢枳殼的中藥替代資源。

藥用植物生長發(fā)育與次生代謝受多種環(huán)境因素影響，包括海拔、經(jīng)緯度、光照等。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)地、經(jīng)緯度、海拔顯著影響衢枳殼及其近緣種中黃酮苷類成分含量的積累。從柚皮苷的含量來看，衢枳殼及其近緣種種植于低經(jīng)度、高緯度、高海拔的地區(qū)，可能有利于提高衢枳殼及其近緣種中的柚皮苷含量，為衢枳殼的種植研究提供依據(jù)，但是，低經(jīng)度、高緯度、高海拔的地區(qū)并不利于新橙皮苷含量的積累。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)綜合種質(zhì)、產(chǎn)地、經(jīng)緯度與海拔等多因素考慮，選擇適宜的衢枳殼種植區(qū)域。下一步，我們將針對(duì)同一區(qū)域不同海拔栽培的衢枳殼進(jìn)行資源收集與黃酮苷類成分含量測(cè)定，以期為衢枳殼的人工栽培提供更多的參考依據(jù)。[本文受浙江省麗水市科技計(jì)劃項(xiàng)目（浙大合作項(xiàng)目）2018zdhz11 支持]