刺五加對大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的影響及腦內(nèi)GABA、L-Glu含量變化的研究

張正一，李廷利，王艷艷，于爽，黃莉莉，楊帆，卞宏生

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

人類的睡眠-覺醒行為是千百年來與晝夜節(jié)律相適應(yīng)而形成的一種穩(wěn)定的行為特征，是人類生命活動的重要內(nèi)容，與人的生命健康息息相關(guān)。但據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查表明，全球27%的人都存在睡眠問題。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)今由于人們的生活方式發(fā)生了重大改變，諸多因素如因熬夜學(xué)習(xí)、工作、上網(wǎng)等人為延長光照時間[1]，飲食無規(guī)律[2]等破壞了晝夜節(jié)律，進(jìn)而影響了機(jī)體的睡眠-覺醒節(jié)律。其中，人為地延長光照時間是造成睡眠-覺醒節(jié)律變化的重要原因，導(dǎo)致失眠，威脅人們的生命健康[3]。而現(xiàn)代研究表明，腦內(nèi)谷氨酸(Glu)，γ-氨基丁酸(GABA)是睡眠調(diào)節(jié)中不可或缺的重要因素[4]，亦是研究睡眠機(jī)制的重要切入點(diǎn)之一。

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根莖或莖[5]。早在南北朝時期，《炮炙論》中對刺五加就有“陽人使陰，陰人使陽”的記載[6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)刺五加對睡眠節(jié)律有調(diào)節(jié)作用，在治療失眠、神經(jīng)衰弱等方面有顯著療效。研究發(fā)現(xiàn)刺五加中有多種成分均具有使患者提前入睡、增加睡眠時間和深度的功效[7]。課題組也發(fā)現(xiàn)刺五加對睡眠節(jié)律有調(diào)節(jié)作用，可減少24 h持續(xù)黑暗環(huán)境下果蠅的片段化睡眠[8]。

基于此，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，利用實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測系統(tǒng)，以SD雄性大鼠為研究對象，探討刺五加對大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的影響及腦內(nèi)GABA、L-Glu含量的變化。

1 材料

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測系統(tǒng)：型號CLAMS，美國COLUMBUS公司(注：該系統(tǒng)由活動評價模塊和睡眠探測分析模塊兩部分組成，構(gòu)成系統(tǒng)的睡眠高通量篩選功能)；多功能酶標(biāo)儀：型號SynergyMx,美國伯騰儀器有限公司；分析天平：型號MS204S，美國梅特勒一托力多儀器上海有限公司；高速低溫冷凍離心機(jī)：型號3-18R(3006004)，美國TOMOS有限公司。

1.2 藥品與試劑

刺五加浸膏(刺五加苷B含量為0.546%，刺五加苷E含量為0.328%,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理教研室提供)，臨用時以生理鹽水配制成24.3 mg/mL的溶液；戊巴比妥鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號WS20060401，臨用時以生理鹽水配制成0.5 mg/mL溶液；GABA ELISA Kit，R&D Systems Inc，Lot 20180501A；L-Glu ELISA Kit，R&D Systems Inc，Lot 20180501A。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(300±50)g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。實(shí)驗(yàn)環(huán)境為屏蔽、隔音、避光、通風(fēng)狀態(tài)，采用自動定時光控系統(tǒng)對大鼠的生活環(huán)境實(shí)行12 h/12 h明暗交替的光照周期處理(即7∶00—19∶00光照；19∶00—次日7∶00黑暗)，光照強(qiáng)度：300 lux，濕度：40 %～70 %，室溫：(24±3) ℃，噪聲≤40 dB。

2 方法

2.1 刺五加對持續(xù)光照條件下大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的干預(yù)研究

將大鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下飼養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境，期間自由飲水和獲取食物。1周后取大鼠18只，隨機(jī)分為正常光照組(LD組)、持續(xù)光照組(LL組)、給藥組(LLG組)，每組6只。分別將LD組、LL組大鼠放于CLAMS系統(tǒng)內(nèi)，設(shè)定采集率為1samples/30 s，即系統(tǒng)每30 s自動收集1次樣本數(shù)據(jù)。以活動次數(shù)count=0，活動閾值epochs=30 s下，單籠飼養(yǎng)，在正常光照和持續(xù)光照條件下，于19∶00—20∶00定時給予與LLG組等劑量的生理鹽水，連續(xù)7 d，記錄大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律以及睡眠時間。將LLG組大鼠放于CLAMS系統(tǒng)內(nèi)，設(shè)定同上，進(jìn)行連續(xù)7 d的持續(xù)光照后，于19∶00—20∶00定時給予60.75 mg/kg刺五加溶液，連續(xù)7 d，記錄大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律以及睡眠時間。

2.2 刺五加對持續(xù)光照條件下大鼠腦內(nèi)GABA、L-Glu的含量變化研究

將大鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下飼養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境，期間自由飲水和獲取食物。1周后取SD大鼠30只，隨機(jī)分為正常光照白天組、正常光照夜晚組、持續(xù)光照白天組和持續(xù)光照夜晚組，給藥白天組，給藥夜晚組，每組6只。將6組大鼠按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于給藥的最后1日11∶00和23∶00，分別戊巴比妥鈉腹腔注射使大鼠麻醉(40 mg/kg)后斷頭取腦，在分析天平中精密稱重后，加入9倍量的生理鹽水在冰浴中勻漿，將勻漿液離心，3 000 r/min離心10 min，分離上層血清，置于低溫冰箱中保存。根據(jù)試劑盒說明書操作，數(shù)據(jù)記錄在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。(注：11∶00和23∶00的時間選取由睡眠-覺醒節(jié)律圖以及睡眠時間中具有顯著性差異的時間段所決定)

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 刺五加對持續(xù)光照條件下大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的干預(yù)研究

3.1.1 刺五加對持續(xù)光照條件下大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的研究

正常光照組大鼠的睡眠-覺醒呈現(xiàn)晝夜節(jié)律變化，節(jié)律周期穩(wěn)定。表現(xiàn)為大鼠白天的休息間隔較多處于睡眠狀態(tài)，夜晚的活動間隔較多處于覺醒狀態(tài)，且睡眠呈現(xiàn)片段化。與正常光照組比較，持續(xù)光照組大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律的節(jié)律相位后置，晝夜節(jié)律特征退化，節(jié)律周期改變。在最初的1 d內(nèi)大鼠的節(jié)律仍保持為作為夜行動物的基本節(jié)律，隨著時間的延長，節(jié)律相位后置日趨明顯，從第2 天起大鼠的晝夜節(jié)律明顯發(fā)生改變，表現(xiàn)為大鼠9∶00—11∶00較多處于覺醒狀態(tài)，19∶00—23∶00較多處于睡眠狀態(tài)，且睡眠呈現(xiàn)片段化。這種現(xiàn)象以第7天最明顯，詳見圖1。

注：A.LD組；B.LL組；C.LLG組。箭頭顯示第7天結(jié)果。

3.1.2 刺五加對持續(xù)光照條件下大鼠睡眠時間的研究

結(jié)果顯示,與正常光照組比較，第7天，9∶00—11∶00持續(xù)光照組睡眠時間減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。19∶00—21∶00、19∶00—21∶00、21∶00—23∶00、23∶00—1∶00及5∶00—7∶00持續(xù)光照組睡眠時間均增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。與持續(xù)光照組比較，第7天，9∶00—11∶00給藥組睡眠時間增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 各時間段刺五加對持續(xù)光照條件下大鼠睡眠時間的影響

3.2 刺五加對持續(xù)光照條件下大鼠腦內(nèi)GABA、L-Glu的含量變化研究

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在11∶00時，與正常光照組比較，持續(xù)光照組GABA含量下降，L-Glu含量升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與持續(xù)光照組比較，給藥組GABA含量升高(P<0.05)。在23∶00時，與正常光照組比較，持續(xù)光照組GABA含量升高，L-Glu含量下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與持續(xù)光照組比較，給藥組GABA含量下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 刺五加對持續(xù)光照條件導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)GABA、L-Glu含量變化的干預(yù)作用

4 討論

隨著社會的發(fā)展和進(jìn)步，諸如跨時區(qū)交流、加班倒班、手機(jī)上網(wǎng)等工作或娛樂活動日趨普遍，人們面臨的睡眠問題也逐漸發(fā)生變化[9]。通過對中國知網(wǎng)近10年的檢索報告進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),以“睡眠”和“節(jié)律”為主題的相關(guān)研究報告呈現(xiàn)大幅度上升趨勢，其中節(jié)律紊亂性睡眠障礙正在成為威脅現(xiàn)代人身心健康的重要問題，引起學(xué)者的高度關(guān)注[10-11]。

針對這種節(jié)律紊亂導(dǎo)致的失眠問題，中醫(yī)藥有其獨(dú)特的認(rèn)識?！侗静菥V目》記載刺五加具有“補(bǔ)中益氣，強(qiáng)筋骨意志，久服輕身耐老”的功效。2020年版《中國藥典》也指出其“益氣健脾，補(bǔ)腎安神”的作用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，刺五加具有改善心腦血液循環(huán)、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，對習(xí)慣性失眠、神經(jīng)衰弱和食欲不振有顯著療效[12-13]。目前，刺五加已成為一種“適應(yīng)原”樣藥物和保健食材被很多國家廣泛使用，且基本無不良反應(yīng)報道[14]。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，L-Glu與GABA是腦內(nèi)最重要的興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對大腦皮層、丘腦、海馬神經(jīng)元有很強(qiáng)的興奮作用，而腦內(nèi)的L-Glu與GABA代謝主要通過L-Glu/GABA-Gln代謝環(huán)路進(jìn)行循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)L-Glu/GABA-Gln的興奮/抑制功能失衡與睡眠-覺醒節(jié)律密切相關(guān)[7-9]，L-Glu/GABA-Gln代謝環(huán)路是腦內(nèi)L-Glu和GABA代謝轉(zhuǎn)換的主要途徑[10]，因此考慮睡眠-覺醒節(jié)律改變是否與L-Glu/GABA-Gln代謝環(huán)路的失衡相關(guān)。

本研究利用實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測系統(tǒng)CLAMS和酶聯(lián)免疫測定技術(shù)，以睡眠-覺醒節(jié)律和睡眠時間以及腦內(nèi)GABA、L-Glu等睡眠促進(jìn)物質(zhì)為指標(biāo)，研究刺五加改善持續(xù)光照條件下大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的作用及其腦內(nèi)GABA、L-Glu的含量變化研究。

目前分析睡眠-覺醒狀態(tài)的常用方法有3種，分別是皮層腦電圖(EEG)、視頻數(shù)字分析方法，以及利用CLAMS紅外光束IR的高通量篩選方法，本文利用CLAMS記錄大鼠睡眠-覺醒節(jié)律，優(yōu)勢在于在不損傷動物的前提下，可以長時間進(jìn)行記錄大鼠的活動狀態(tài)，從而繪制睡眠-覺醒節(jié)律圖。

在刺五加對持續(xù)光照條件下大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的干預(yù)研究中發(fā)現(xiàn),刺五加可以通過調(diào)整大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律分布，使處于持續(xù)光照條件下大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律紊亂現(xiàn)象得到恢復(fù)，與正常光照組相比，持續(xù)光照條件下的大鼠，在9∶00—11∶00多處于覺醒狀態(tài)，21∶00—23∶00多處于睡眠狀態(tài)的睡眠-覺醒行為表現(xiàn)，經(jīng)過刺五加給藥后又恢復(fù)到與正常光照組相近的節(jié)律分布，可以看出在9∶00—11∶00多處于睡眠狀態(tài)，21∶00—23∶00多處于覺醒狀態(tài)，這種現(xiàn)象以11∶00和23∶00前后最為突出。且通過對睡眠覺醒節(jié)律圖以及睡眠時間的研究，我們可以發(fā)現(xiàn)，無論是將持續(xù)光照組大鼠與正常光照組大鼠相比較，還是將給藥組大鼠與持續(xù)光照組大鼠相比較，11∶00和23∶00這兩個時間段，差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?；诖耍诖笫竽X內(nèi)GABA、L-Glu含量研究中，選定11∶00和23∶00這兩個時間段，進(jìn)行大鼠斷頭取腦的操作，利用酶聯(lián)免疫測定技術(shù)，測定腦內(nèi)GABA、L-Glu的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn),在11∶00時，與正常光照組比較，持續(xù)光照組GABA含量下降，L-Glu含量升高；與持續(xù)光照組比較，給藥組GABA含量升高，具有顯著性差異(P<0.05)。在23∶00時，與正常光照組比較，持續(xù)光照組GABA含量升高，L-Glu含量下降；與持續(xù)光照組比較，給藥組GABA含量下降，具有顯著性差異(P<0.05)。

本研究從較為直觀的角度，即睡眠-覺醒節(jié)律圖和睡眠時間，展現(xiàn)了刺五加可以改善大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律；并通過L-Glu和GABA含量的變化，探討了刺五加能通過調(diào)節(jié)大鼠的節(jié)律分布來改善大鼠的睡眠，其作用機(jī)制可能是通過影響L-Glu、GABA的含量變化而改善大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律。本研究從睡眠-覺醒節(jié)律角度揭示了刺五加改善睡眠的機(jī)制，同時為其他相關(guān)中藥及制劑改善睡眠的研究提供了參考。