固本防哮飲對哮喘合并食物過敏小鼠NLRP3炎癥小體通路的影響

候淑婷，陸遠，趙霞*，邢瓊瓊，嚴花，尤焱南

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科研究所 江蘇省兒童呼吸疾病中醫(yī)藥重點實驗室，江蘇 南京 210023；3.蘇州大學附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

哮喘是以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，若兒童時期遷延失治可延及成人時期[1]。引起哮喘反復發(fā)作的誘因繁雜，而食物過敏是兒童最常見的誘因之一[2]，如果診治不及時，隨著過敏原的反復刺激，可加重加快哮喘氣道不可逆性縮窄和氣道重塑病程的發(fā)展。因此，針對食物過敏原誘發(fā)的哮喘，早期干預治療對提高療效具有重要意義。《醫(yī)旨緒余·哮》曰：“有飲食厚味傷脾，不能運化而發(fā)者”。脾傷則津液不得布散而生痰涎，壅塞經隧，肺氣為之不利。故中醫(yī)在哮喘的治療中強調“益氣固表，培土生金”。固本防哮飲是兒科專家江育仁教授治療哮喘緩解期的經驗方，具有補肺固表，健脾化痰之功效。隨機對照臨床試驗證實固本防哮飲治療緩解期哮喘兒童安全、有效[3]。

研究表明NLRP3炎癥小體介導的IL-1β是誘發(fā)炎癥并導致哮喘的關鍵因素之一，食物誘發(fā)的過敏反應和藥物誘導的哮喘均與NLRP3基因多態(tài)性存在關聯[4]。哮喘兒童在攝入致敏性食物后，食物抗原被胃腸道吸收，與胃腸道淋巴結產生炎癥反應，并經淋巴或血液循環(huán)而對肺部造成影響，進而誘發(fā)呼吸道的癥狀[5]。腸道、呼吸道炎癥疾病發(fā)生發(fā)展與NLRP3炎癥小體通路都有密切聯系[6-7]，在這些疾病進展中皆存在NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達升高[8]。此外有研究表明,在嚴重和類固醇抵抗類型的哮喘中的氣道炎癥發(fā)生皆與NLRP3、IL-1β表達水平相關[9]，而抑制NLRP3 /IL-1β信號傳導途徑可以降低相關促炎因子的產生，改善肺部通氣功能[9-10]。在炎癥反應相關通路上，NLRP3炎癥小體通路作為關鍵環(huán)節(jié)，其釋放促炎細胞因子可導致上皮屏障的滲透性增強，而氣道上皮屏障功能的受損與哮喘發(fā)作和進行性加重程度密切相關[11]，這提示NLRP3可能是防治哮喘合并食物過敏氣道炎癥的重要靶標。課題組前期研究在RSV-OVA聯合造模小鼠中也顯示哮喘氣道上皮屏障完整性受損，表現為較高的上皮通透性，炎性細胞因子分泌增加[12]，而固本防哮飲可以減少B細胞活化和IgE的釋放[13]。基于此，本研究通過建立哮喘合并食物過敏的小鼠模型，探討固本防哮飲對哮喘合并食物過敏小鼠的氣道上皮屏障保護和NLRP3炎癥小體通路作用的潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠，3～5周齡，體質量18～20 g ，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.2 主要試劑與儀器

孟魯司特鈉顆粒劑(4 mg/袋，產品批號：0001050050，杭州默沙東藥業(yè)股份有限公司)；卵蛋白(OVA，批號：326A058，美國 Sigma 公司)；BCA蛋白定量試劑盒(批號：23227，美國Thermo Scientific公司)；DEPC水 (批號：R0021)；RIPA裂解液 (批號：P0013B)；PowerPac Basic電泳槽、Chemi- Doc化學發(fā)光成像儀：美國 Bio-Rad 公司；美國M200 PRO酶標儀；兔抗NF-κB小鼠多克隆抗體(貨號：ab7970) 與山羊抗兔多克隆二抗 (貨號：ab6721) 來源于美國Abcam公司；兔抗IL-1β小鼠多克隆抗體(貨號：12242S) 與兔抗NLRP3小鼠多克隆抗體(貨號：15101S)來源于Cell Signaling Technology公司；兔抗caspase-1小鼠多克隆抗體(貨號：22915-1-AP) 與山羊抗鼠多克隆二抗 (貨號：SA00001-1)來源于Proteintech公司；兔抗GAPDH小鼠多克隆抗體(貨號：100494-1-AP)、兔抗claudin-1小鼠多克隆抗體 (貨號：13050-1-AP) 、兔抗E-cadherin小鼠多克隆抗體 (貨號：20874-1-AP)、兔抗occludin小鼠多克隆抗體 (貨號：27260-1-AP)均來源于Proteintech公司；山羊抗兔多克隆二抗 (貨號：ab6721)來源于美國Abcam公司。

1.3 藥物制備

固本防哮飲飲片購于江蘇省中醫(yī)院，黃芪、黨參、白術、茯苓、煅牡蠣、蟬蛻、陳皮、防風、辛夷、五味子、甘草按照配伍比例為5∶3.33∶3.33∶3.33∶5∶2∶2∶1∶2∶2∶1組成。先將煅牡蠣煮30 min，其余藥材用蒸餾水室溫浸泡30 min，然后將所有藥材混合，分別用8和6倍(v/w)蒸餾水煮沸2次，每次30 min，最后將獲得的上清液混勻，在負壓下65 ℃，濃縮至3 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｙ|量控制按前期研究的方法進行[14]。

1.4 動物造模、分組及給藥

實驗小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，除正常組外的小鼠分別在第1、14天給予腹腔注射0.2 mL致敏液(OVA 100 μg，氫氧化鋁凝膠1 mg，溶解于0.9%的氯化鈉溶液中)，正常組以0.2 mL 0.9%的氯化鈉溶液腹腔注射。第28天用0.25 mL 灌胃液(OVA 50 mg，溶解于0.9%的氯化鈉溶液中)進行食物過敏原激發(fā)，每2 d 1次，共6次。然后在第40、45、50天，以 50 μL OVA(1 mg/mL，溶解于0.9%的氯化鈉溶液中)進行氣道激發(fā)。正常組以同體積0.9%的氯化鈉溶液代替灌胃或滴鼻。腹腔致敏后11 d(第25天)，將造模小鼠分為正常組(control)、單純氣道模型組(AR)、聯合模型組(FAR)、聯合模型組+固本防哮飲組(GBFXD)(給予聯合模型組固本防哮飲24 g生藥/kg)、聯合模型組+孟魯司特鈉組(Mont)(給予孟魯司特鈉顆粒劑2.6 mg/kg)干預，每日灌胃給藥1次，共28 d，兩種模型組、正常組小鼠給予20 mL/kg 0.9%的氯化鈉溶液灌胃。給藥劑量參照陳奇《中藥藥理研究方法學》，末次給藥24 h后，處死，取相應組織-80 ℃存儲備用。

1.5 肺病理染色

小鼠右肺中葉用4%多聚甲醛溶液4 ℃固定過夜，常規(guī)石蠟包埋切片(厚度約為5 μm)，進行HE染色。在倒置顯微鏡下觀察HE染色中炎性細胞浸潤情況，進行病理組織評分。炎癥評分為：0級，無炎癥；1級，偶見炎癥細胞；2級，支氣管或血管周圍的1～2層炎癥細胞；3和4級分別代表3～5層細胞中層，或5層以上的炎癥細胞。

1.6 免疫熒光檢測

石蠟切片經脫蠟后進行抗原修復，用PBST洗滌3次，每次5 min。以5%山羊血清室溫封閉60 min，加入一抗claudin-1(1∶300)，4 ℃過夜。用PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗Alexa fluor 488，室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次。Dapi復染后PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察。將一抗更換為occludin(1∶200)、E-cadherin(1∶300)分別進行免疫熒光檢測。

1.7 NLRP3/IL-1β信號通路中關鍵蛋白的檢測

將組織蛋白裂解液加入各組小鼠的肺組織中，使用球磨儀進行充分研磨，然后放置冰上30 min后，4 ℃ 13 000 r/min離心取上清液，BCA法測定蛋白濃度，將上樣蛋白濃度定為2 μg/μL，煮沸5 min進行蛋白變性;分別配制分離膠和積層膠，按照S1 80V 30 min、S2 110V 60 min進行電泳；電泳后進行轉膜，轉膜后用3%BSA封閉，置搖床上2 h后，用1×TBST洗膜3次，分別加入按1∶600、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶10 000比例稀釋的NF-κB、NLRP3、IL-1β、caspase-1、β-actin一抗，4 ℃過夜；1×TBST洗膜3次，常溫下用1∶10 000稀釋的二抗于搖床上孵育2 h，1×TBST洗膜3次，5 min/次，然后進行條帶曝光。用Image J軟件處理各條帶，以目的蛋白與β-actin的灰度比值作為目的蛋白的相對含量。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 固本防哮飲對哮喘小鼠的肺部炎癥的影響

與control組相比，AR和FAR組支氣管和血管周圍見炎癥細胞浸潤(P<0.05)，且FAR較AR組見明顯氣道炎癥(P<0.05)，而GBFXD治療可抑制其炎癥細胞浸潤(P<0.01)，見圖1。病理評分結果見圖2。

圖1 小鼠肺組織HE染色(×200)

注：與control組相比，**P<0.01；與AR組相比，△P<0.05;與FAR組相比，##P<0.01。

2.2 固本防哮飲對哮喘小鼠的肺部連接蛋白的影響

與control組相比，AR和FAR組小鼠肺組織中的claudin-1無顯著變化(P>0.05)，而occludin、E-cadherin的表達水平顯著降低(P<0.05)，與FAR相比，GBFXD小鼠肺組織中的occludin、E-cadherin顯著上調(P<0.05)，見圖3。

注：與control組相比，*P<0.05，**P<0.01；與FAR組相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 固本防哮飲對NLRP3/IL-1β信號通路中相關蛋白的調控

與control組相比，AR和FAR組小鼠肺組織中的caspase-1、NLRP3、NF-κB、IL-1β的表達水平顯著升高(P<0.05)，與FAR組相比，GBFXD小鼠的肺組織中的caspase-1、NLRP3、NF-κB、IL-1β顯著降低(P<0.05)，見圖4。

注：與control組相比，*P<0.05，**P<0.01；與FAR組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

NLRP3是NOD樣受體(NLRs)家族中研究最廣泛的一個成員，NLRP3炎性小體的多蛋白復合物由傳感器-NLRP3，包含半胱天冬酶募集結構域(ASC)、效應蛋白-半胱天冬酶-1(caspase-1)和適配子-凋亡相關的斑點樣蛋白組成，廣泛存在于上皮細胞和免疫細胞中[15]。作為NLRP3炎性小體的核心蛋白，NLRP3蛋白的C端保守的LRRs域可以調節(jié)NLRP3活性，并檢測內源性警報蛋白和微生物配體；N末端吡啶結構域(PYD)可以解釋與銜接子蛋白ASC的同型相互作用。在ASC包含兩個轉導結構域，一個是可連接上游NLRP3的吡啶結構域，另一個是可連接下游caspase-1的半胱天冬酶募集結構域(CARD)caspase-1作為NLRP3炎性體的效應蛋白，可以將pro-IL-1β和pro-IL-18轉化為它們的活性形式IL-1β和IL-18[16]，而釋放到胞外的IL-1β能誘導上皮緊密連接(TJ)通透性增加,在炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。研究表明在腸道炎癥中，IL-1β誘導的腸上皮緊密連接通透性的增加是由NF-κB通路的MEKK-1激活介導，NLRP3炎性小體可以誘導有效的炎癥反應，氧化應激和促炎細胞死亡，炎癥和氧化應激可誘導內皮損傷，激活NF-κB信號通路，NF-κB信號通路的激活增加了促炎性介質(如細胞因子和趨化因子)的分泌，介導白細胞的粘附并促進白細胞的外滲等反應，進而導致肌動蛋白結合蛋白磷酸化，肌動蛋白應激纖維形成，細胞骨架重塑和內皮收縮，所有這些反應改變了細胞的收縮力和破壞細胞間的連接增加內皮的通透性[17]。

哮喘和食物過敏之間聯系緊密，兩者間具體的相互作用和潛在機制尚不清楚，但這兩種異質性疾病的發(fā)病率近幾年來顯著增加。在兒童人群中觀察到的變異報告顯示[18]，約3.5%～8%的兒童有食物過敏，約14%的兒童有哮喘癥狀。有報告顯示，48%的哮喘患者有食物過敏，約有一半的食物過敏兒童有呼吸道過敏癥狀；哮喘患者與非哮喘患者比較，45%的哮喘患者存在食物過敏。另一方面，哮喘患者往往會出現多種嚴重的食物過敏，食物過敏常與哮喘控制不良有關。哮喘和食物過敏的共存，具有顯著的臨床相關性,增加危及生命的哮喘發(fā)作的風險，以及食物過敏原觸發(fā)哮喘發(fā)作或食物過敏，故及時防治在疾病的進展中具有重要意義。

固本防哮飲是江育仁教授在二陳湯和玉屏風散基礎上加減而成。方中黃芪、黨參、防風、白術益氣固表；陳皮、茯苓、甘草健脾益氣；煅牡蠣固澀補腎、蟬蛻祛風、辛夷宣竅斂肺、五味子補氣斂肺，全方扶正與驅邪并施，攘外與安內并行，在健脾益肺、補肺固表同時，也補腎納氣。中醫(yī)藥治療疾病講究整體觀念，重視疾病之間的聯系作用。明代兒科醫(yī)家萬全在《萬氏家藏育嬰秘訣·五臟證治總論》中指出小兒的體質特點為：“五臟之中脾常不足腎常虛……嬌肺遭傷不易愈”[19]。哮喘的發(fā)病是由于體內的“伏痰”在外來因素的誘導導致的氣因痰阻，痰阻氣結而發(fā)病。《醫(yī)學入門·卷之四》曰：“痰原于腎, 動于脾, 客于肺，水火升降，脾胃調和，痰從何生”[20]。故在治療中強調肺脾腎的重要性。食物導致的過敏是哮喘發(fā)生的外因，哮喘引起患者自身的免疫反應是其反復發(fā)作的內因。內在可控，外因難防，故早期保護屏障的完整，減少外來病原體的入侵，降低炎癥風暴效應，在哮喘的治療中有顯著作用。

由于卵清蛋白是引起食物過敏的主要物質，在本此實驗研究中，采用OVA誘導單純呼吸道和哮喘合并食物過敏混合小鼠模型。研究中，我們觀察到混合模型小鼠的氣道炎癥顯著增加，而固本防哮飲可以上調在聯合模型中的屏障連接蛋白occludin、E-cadherin表達，保護氣道屏障的完整，抑制NLRP3炎癥小體通路及下游NF-κB炎癥信號的激活，減低食物過敏加重的哮喘氣道炎癥。這進一步為固本防哮飲治療兒童哮喘提供了理論基礎，也為中醫(yī)藥多靶點、多途徑理論研究提供科學依據。近幾年越來越多證據顯示臨床控制哮喘發(fā)作藥物，在安全性方面有較大爭議。其中孟魯司特鈉在2020年被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)發(fā)布黑框警告：其可誘發(fā)嚴重神經精神不良事件，建議限制使用。而中醫(yī)藥在治療哮喘方面具有獨特的優(yōu)勢，且相對安全有效，其治療機制值得進一步深入研究。