芪薊腎康湯對AngⅡ誘導人腎小球系膜細胞增殖及STAT3、SOCS3表達的影響

郭建儀，呂靜，張春輝，莊曉巖，張忠勝

(1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

IgA腎病(IgA nephropathy)是指以IgA為主的免疫復合物沉積在腎小球系膜區(qū)的腎小球疾病[1]。流行病學顯示，在中國乃至世界，IgA腎病在原發(fā)性腎小球疾病中發(fā)病率始終高居首位，此病最終會發(fā)展成為終末期腎病[2]。目前，IgA腎病的具體發(fā)病原因尚不清楚，其臨床治療藥物西醫(yī)多選擇糖皮質(zhì)激素或者免疫抑制劑，但后期隨著用藥劑量的增加，極容易出現(xiàn)肝腎損害，誘發(fā)感染[3]。陳以平全國名老中醫(yī)工作室通過對IgA腎病做回顧性分析，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥單獨或聯(lián)合應用均可改善IgA腎病患者的腎功能減退，越早加入中醫(yī)藥治療，越能延緩腎功能下降[4]。

芪薊腎康湯是專利方，臨床有效治療IgA腎病30多年。JAK/STAT信號通路是信號轉導的常用途徑[5]，可能與IgA腎病存在聯(lián)系。轉錄激活蛋白3(STAT3)能夠激活通路并促進信號轉導[6]，細胞因子信號轉導抑制因子3(SOCS3)作為負調(diào)節(jié)因子，則反向抑制[7]。因此，為研究芪薊腎康湯治療IgA腎病的分子機制，本實驗觀察芪薊腎康湯低、中、高劑量組及替米沙坦組對AngⅡ誘導人腎小球系膜細胞(HMCs)影響，采用ELISA法檢測血清中STAT3蛋白表達的情況,qPCR法檢測SOCS3 mRNA 表達量，分析芪薊腎康湯治療IgA腎病作用機制及靶點。

1 材料

1.1 動物

40只健康雄性大鼠，購自遼寧長生生物技術有限公司，批號：SCXK(遼)2015-0001，飼養(yǎng)在遼寧中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心。

1.2 細胞株

人腎小球系膜細胞株，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.3 中藥材

芪薊腎康湯(黃芪、丹參、牡丹皮、仙鶴草、重樓、白花蛇舌草、老頭草、小薊等8味中藥)，由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供；替米沙坦片(80 mg/片，上海勃林格殷翰藥業(yè)有限公司)。

1.4 主要儀器及試劑

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ，Wako公司)；ROX plus(Takara公司)；小牛血清(FBS，GIBICO公司)；STAT3 ELISA試劑盒(AMEKO公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(HyClone公司)；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將人腎小球系膜細胞培養(yǎng)2 d后，換成RPMI-1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，接種到培養(yǎng)瓶中。在鏡下觀察細胞，等到細胞株覆蓋瓶底80%，吸出原培養(yǎng)液，丟棄，用緩沖液輕輕沖洗培養(yǎng)瓶，加胰酶3 mL，放置在37 ℃、0.5% 濃度的CO2培養(yǎng)箱消化5 min。消化之后，從培養(yǎng)箱取細胞，顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細胞完全脫離，終止消化，形成細胞懸液。在離心管中加細胞懸液15 mL，設置參數(shù)4 ℃、2 000 r/min，離心10 min，吸取上清，在細胞沉淀中加入完全培養(yǎng)液，備用。

2.2 血清制備

將40只大鼠隨機分為正常組，替米沙坦組(6.25 mg·kg-1·d-1)，芪薊腎康湯低、中、高劑量組(11.8、23.6、47.2 g·kg-1·d-1)。先適應性喂養(yǎng)3 d，3 d后連續(xù)藥物灌胃5 d，1次/d。5 d之后，脫頸處死，解剖腹主動脈，采血并分離血清，置于-20 ℃冰箱備用。

2.3 指標檢測

2.3.1 MTT法檢測細胞增殖

將細胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板，包括6組，正常組，模型組，替米沙坦組，芪薊腎康湯組分低、中、高劑量組。先培養(yǎng)24 h，24 h后吸出原培養(yǎng)液，在每孔加RPMI-1640 培養(yǎng)液150 μL。24 h后，棄上清，再按照分組加200 μL芪薊腎康湯或替米沙坦含藥血清，放到CO2培養(yǎng)箱。48 h之后，加入MTT培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)，檢測OD值。

2.3.2 ELISA法檢測48 h、72 h STAT3表達

根據(jù)預實驗結果，選擇在48 h、72 h 后取上清液，用ELISA試劑盒反應并檢測OD值。

2.3.3 qPCR法檢測48 h SOCS3表達

引物由 Primer-BLAST[8]設計，內(nèi)參基因是人β-actin，所得Ct值利用2-△△CT公式[9]計算出SOCS3 mRNA的表達量，使用的引物序列及產(chǎn)物情況，見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 細胞增殖結果

各組增殖情況見表2。模型組與正常組相比，有明顯差異(P<0.01)，結合數(shù)值，模型組細胞增殖最為明顯，證明造模成功。與模型組相比較，替米沙坦組、芪薊腎康湯中劑量組和高劑量組結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，芪薊腎康湯高劑量組緩解細胞增殖效果最明顯，芪薊腎康湯高劑量組和中劑量組系膜細胞增殖情況都低于替米沙坦組。

表2 各組細胞增殖情況

3.2 芪薊腎康湯對STAT3的蛋白表達影響

48 h，在AngⅡ的刺激下，與正常組相比，模型組的STAT3含量明顯增高 (P<0.01)；與模型組相比，芪薊腎康湯高、中、低劑量組及替米沙坦組均能降低STAT3的蛋白表達(P<0.01)，而且隨著芪薊腎康湯劑量增加，降低STAT3的效果越明顯，中、低劑量組效果低于替米沙坦組，芪薊腎康湯高劑量組明顯高于替米沙坦組，作用最強(P<0.01)。72 h，與模型組相比，芪薊腎康湯高、中、低劑量組及替米沙坦組均有效降低STAT3的蛋白表達。說明芪薊腎康湯可以有效降低STAT3蛋白表達，見表3。

表3 各組48 h、72 h時STAT3含量

3.3 芪薊腎康湯對SOCS3的mRNA表達影響

基因表達結果表明，模型組SOCS3的mRNA表達與正常組相比顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，替米沙坦組，芪薊腎康湯低、中、高劑量組均可促進SOCS3 mRNA表達(P<0.01)。芪薊腎康湯組隨著劑量的增加，促進SOCS3 mRNA表達的效果越明顯。芪薊腎康湯中、低劑量組SOCS3 mRNA含量表達低于替米沙坦組，芪薊腎康湯高劑量組與替米沙坦組SOCS3 mRNA表達量相近。說明芪薊腎康湯能夠促進SOCS3 mRNA的表達，抑制AngⅡ誘導下人腎小球系膜細胞的增殖狀態(tài)，見表4。

表4 各組SOCS3含量比較

4 討論

腎小球硬化是IgA腎病的重要病理特點[10]，會出現(xiàn)系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)積聚，其中局灶節(jié)段性腎小球硬化可以作為IgA腎病早期預后的指標[11]。AngⅡ是公認致腎小球硬化的因子[12]，因此選擇AngⅡ誘導HMCs增殖。替米沙坦是血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥，廣泛用于臨床腎病治療，減輕腎臟纖維化[13-14]，因此選擇替米沙坦作對比。

JAK/STAT信號通路參與細胞增殖過程，可以與其他信號通路相互影響。JAK/STAT包括JAK相關受體、JAK和轉錄因子STAT，其中STAT蛋白是重要的生物標志物。STAT家族包含STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6等7種蛋白[15]。細胞因子與JAK受體結合后會激活JAK，而活化的JAK能使STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3形成二聚體，結合靶基因，調(diào)控基因表達[16]。活化的STAT可促進負性調(diào)節(jié)分子SOCS的表達，而SOCS3能阻斷STAT3與受體的結合，抑制STAT3的活化[17]。因此，檢測芪薊腎康湯和替米沙坦含藥血清對STAT3、SOCS3表達的影響，分析其可能的作用機制。

中醫(yī)學通常將IgA腎病歸于“尿血”“水腫”范疇。不同中醫(yī)學家對其發(fā)病機制有不同見解。王耀獻教授認為風邪為始發(fā)因素，與濕邪膠結致病，主張從風濕論治，以搜風祛濕為主[18]。劉光珍教授認為在IgA腎病不同分期，血瘀貫穿始終，治療該以活血化瘀為主[19]。劉偉敬教授認為應從風、虛、瘀論治[20]。吾師認為虛、毒、瘀是致病之關鍵，因此從“補腎絡、清腎絡、消腎絡”角度進行防治。芪薊腎康湯正是以此法立方，包括黃芪、丹參、牡丹皮、仙鶴草、重樓、白花蛇舌草、老頭草、小薊等8味中藥。

實驗制備芪薊腎康湯低、中、高劑量含藥血清，作用于AngⅡ誘導的HMCs，檢測STAT3、SOCS3表達情況，并與正常組、模型組、替米沙坦組對照。ELISA法檢測STAT3蛋白含量，48 h時，STAT3模型組水平明顯高于正常組，說明造模成功；芪薊腎康湯組和替米沙坦組STAT3水平均明顯下降，芪薊腎康湯高劑量組STAT3含量最低，72 h結果與48 h基本相同。說明芪薊腎康湯與替米沙坦均可通過降低STAT3表達抑制HMCs增殖，隨著芪薊腎康湯劑量的增加，效果越明顯，高劑量組效果好于替米沙坦組。qPCR檢測48 h時SOCS3 mRNA表達情況，SOCS3是負性調(diào)節(jié)因子，與正常組相比，模型組含量明顯降低，說明造模成功；芪薊腎康湯組與替米沙坦組均可提高SOCS3 mRNA水平，替米沙坦組含量最高，芪薊腎康湯高劑量組含量也很高，且與替米沙坦組差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明芪薊腎康湯與替米沙坦均可通過促進SOCS3表達抑制HMCs增殖，隨著芪薊腎康湯劑量的增加，效果越好。

綜上所述，芪薊腎康湯可以通過正向降低STAT3表達，反向促進SOCS3表達，抑制HMCs增殖，緩解腎小球硬化。這可能是芪薊腎康湯改善IgA腎病的分子機制之一。