高煙堿K326 定向改良材料的創(chuàng)制與分析

鄭淑心，閆筱筱，王召軍，張洪映，崔 紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市金水區(qū)文化路95號(hào) 450002

煙草生物堿是影響煙草品質(zhì)的一類(lèi)重要物質(zhì)［1］。煙草生物堿主要分為煙堿、新煙堿、降煙堿和假木賊堿，其中煙堿含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）占生物堿總量的90%～95%［2］。近年來(lái)，隨著工業(yè)降焦技術(shù)的飛速發(fā)展，卷煙焦油量得到了有效控制，但同時(shí)卷煙產(chǎn)品的煙堿和致香物質(zhì)含量也逐漸減少，導(dǎo)致卷煙產(chǎn)品的香氣減弱［3-4］。而提高煙堿含量的煙葉可在降低焦油釋放量的同時(shí)，最大限度地滿足感官需求，受到工業(yè)企業(yè)的青睞。雖然，栽培措施對(duì)煙堿合成和積累有明顯的調(diào)控作用［5-6］，但僅依靠肥料用量、留葉數(shù)來(lái)調(diào)控?zé)焿A，無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致煙葉發(fā)育不正常以及化學(xué)成分的不協(xié)調(diào)［7-8］。近年來(lái)，CRISPR/Cas9 技術(shù)已實(shí)現(xiàn)了在多個(gè)物種中的應(yīng)用。在煙草中，也相繼實(shí)現(xiàn)了單基因定點(diǎn)突變和多基因靶點(diǎn)敲除，均表明CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的有效性和可行性。因此，采用基因編輯技術(shù)對(duì)煙堿合成相關(guān)基因進(jìn)行編輯，實(shí)現(xiàn)煙堿代謝的定向調(diào)控，對(duì)培育高煙堿烤煙品種具有重要意義。

生物堿的合成過(guò)程不僅受喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移 酶（Quinolinic acid phosphoribosyl trandaferase，QPT）、腐 胺- N -甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶（PutrescineN-methyltransferase，PMT）、鳥(niǎo)氨酸脫氨酶（Ornithine decarboxylase，ODC）和PIP 家族還原酶（A622）等關(guān)鍵酶類(lèi)催化調(diào)控，同時(shí)也受茉莉酸（JA）信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)［9］。JAZ 作為JA 途徑信號(hào)模塊（SCFCOI1-JAZMYC2）的關(guān)鍵抑制因子［10-11］，廣泛參與調(diào)控植株免疫反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育和代謝物質(zhì)的合成等過(guò)程，其中Zhang 等［12］、Howe 等［13］和Wang 等［14］的研究表明，煙草NtJAZ1參與調(diào)控?zé)焿A的合成。另外，煙草JAZ基因沉默激活JA信號(hào)下游相關(guān)基因大量表達(dá)，顯著提高植株對(duì)煙芽夜蛾的抗性［15］。但煙草NtJAZ1基因突變對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育及品質(zhì)的影響卻鮮有報(bào)道。此外，擬南芥AtJAZ1基因在低溫條件下能促進(jìn)植株次生代謝的發(fā)生，提高植株的耐寒性，維持植株正常生長(zhǎng)發(fā)育［16-17］。水稻JAZ可以調(diào)控碳水化合物的合成［18］，在JA介導(dǎo)的白葉枯病抗性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［19］。過(guò)表達(dá)JAZ9的水稻轉(zhuǎn)基因株系通過(guò)調(diào)控離子平衡等顯著提高植株的耐鹽性［20］。因此，以普通烤煙品種K326為材料，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除NtJAZ1基因獲得定向改良的高煙堿材料，并對(duì)其農(nóng)藝性狀、煙堿含量、腺毛密度和葉面化學(xué)成分等進(jìn)行了分析，旨在為培育優(yōu)質(zhì)煙葉原料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為本課題組保存的烤煙品種K326。K326 種子經(jīng)消毒后播種在MS 培養(yǎng)基上，用于農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化。另外，K326突變材料播種于育苗盤(pán)上，按煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行育苗［21］，于2020年5月移栽種植于河南許昌隔離封閉試驗(yàn)田。田間種植和管理按照烤煙栽培技術(shù)流程［22］和當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉栽培規(guī)程進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1NtJAZ1基因敲除載體的構(gòu)建

根據(jù)茄科基因組網(wǎng)站（https：//solgenomics.net/）已發(fā)表的煙草NtJAZ1基因兩個(gè)拷貝的序列（Nitab 4.5_0000073g0270.1、Nitab4.5_0004234g0080.1），利用CRISPR2 在線軟件（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRIS PR2/）設(shè)計(jì)gRNA 序列：5′-GCAGTAGAAATAACTT CTTG-3′（341～360 bp），合成Oligo 二聚體后連上CRISPR/Cas9 基因敲除載體。將該載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105 中，根據(jù)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法對(duì)K326 無(wú)菌葉片進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，同時(shí)以空載體進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。

提取突變體和對(duì)照幼苗DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增和靶位點(diǎn)測(cè)序分析其序列突變情況，使用的引物如表1所示。

表1 擴(kuò)增引物序列Tab.1 Amplification primer sequences

1.2.2 植物學(xué)性狀調(diào)查

在煙株現(xiàn)蕾期，按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法［23］分別測(cè)量煙草K326和NK-9的株高、葉數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、莖圍和節(jié)距等農(nóng)藝性狀指標(biāo)，每個(gè)煙草株系測(cè)量10株。

1.2.3 煙堿含量測(cè)定

在現(xiàn)蕾期（移栽后60 d）、打頂期（移栽后75 d）、和成熟期（移栽后90 d），分別選取K326 和NK-9 的中部葉（從下向上數(shù)10～12 葉位）測(cè)定煙堿含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。將葉片置于105 ℃殺青1 h，在85 ℃烘干至恒質(zhì)量。將葉片研磨后過(guò)0.250 mm 孔徑的樣品篩，稱(chēng)取200 mg樣品于甲基叔丁基醚（MTBE）中萃取24 h，轉(zhuǎn)移上清液至氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器（7890A，美國(guó)安捷倫公司）中，按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法［24］進(jìn)行煙堿含量的定量分析，重復(fù)3次。

1.2.4 腺毛形態(tài)觀察與統(tǒng)計(jì)

分別選取K326 和NK-9 中長(zhǎng)度約10 cm 的葉片進(jìn)行腺毛形態(tài)和密度觀察。使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.2%的羅丹明B 溶液染色20～30 min，用無(wú)菌水清洗后，放置于超景深顯微鏡（VHX-5000，日本基恩士公司）下進(jìn)行腺毛形態(tài)拍照和密度統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 葉面化學(xué)成分含量測(cè)定

分別挑選5株生長(zhǎng)狀況良好的K326和NK-9，取其中部葉進(jìn)行葉面化學(xué)成分含量測(cè)定，重復(fù)3次。通過(guò)二氯甲烷浸提、無(wú)水硫酸鈉攪拌干燥，用定量濾紙過(guò)濾至圓底燒瓶中。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加入1 mL 內(nèi)標(biāo)（2.020 mg/mL的八乙酸蔗糖酯+2.542 mg/mL的十七烷醇混合溶液）定容于棕色容量瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將溶劑吹干。然后，加入500 μLV（N，N-二甲基甲酰胺）∶V（N，O-雙三甲硅基三氟乙酰胺）=1∶1 的溶液，在75 ℃水浴中進(jìn)行衍生化反應(yīng)。最后，分別加入N，O-雙乙酰胺和吡啶125 μ L，即為GC/MS 分析樣品液。將樣品液置于GC/MS分析儀（HP-5890，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）中進(jìn)行化學(xué)成分的定性和定量分析，具體方法參考文獻(xiàn)［25］。

1.2.6 常規(guī)化學(xué)成分含量測(cè)定

分別選取K326 和NK-9 的C3F 煙葉于75 ℃烘箱中烘干并研磨成粉，并過(guò)0.250 mm 孔徑的樣品篩，稱(chēng)取0.25 g 煙末于三角瓶中，加入25 mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的醋酸溶液，共振蕩萃取30 min，定性濾紙過(guò)濾后作為待測(cè)液，用連續(xù)流動(dòng)分析儀（AA3，德國(guó)水爾公司）按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法［26-28］測(cè)定水溶性總糖、還原糖、煙堿、氯和鉀含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），重復(fù)3次。

1.2.7 中性香氣物質(zhì)測(cè)定

參照趙銘欽等［29］的方法測(cè)定烤后煙葉（C3F）中性香氣物質(zhì)含量。

1.2.8 生物堿合成相關(guān)基因表達(dá)分析

利用植物總RNA 提取試劑盒（DP4332，天根生化科技有限公司）分別提取K326 和NK-9 的根系總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（NovoScript?ⅡReverse Transcriptase，上海近岸科技有限公司）合成cDNA第一鏈。根據(jù)NCBI GenBank 中的煙堿合成相關(guān)基因（NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT、NtQPT、NtODC和NtA622）序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物，上下游引物見(jiàn)表1，以L25（L18908）為內(nèi)參基因。RT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃2 min；95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃15 s，58 ℃15 s，20 min 內(nèi)升至95 ℃，95 ℃15 s。重復(fù)3 次。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17軟件進(jìn)行單因素方差分析，用最小顯著差數(shù)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用Sigmaplot 14.0軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高煙堿K326突變材料的創(chuàng)制和分子鑒定

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將NtJAZ1基因敲除載體導(dǎo)入K326，經(jīng)過(guò)潮霉素抗性篩選后，共獲得22 株陽(yáng)性植株。分別利用NtJAZ1-1和NtJAZ1-2特異引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序后發(fā)現(xiàn)10株的gRNA序列出現(xiàn)堿基突變，基因編輯效率為45.45%。突變情況分析表明，NtJAZ1-1靶位點(diǎn)序列發(fā)生突變的株系為NK-3、NK-4、NK-8、NK-9、NK-12、NK-15 和NK-17，NtJAZ1-2靶位點(diǎn)序列發(fā)生突變的株系為NK-3、NK-4、NK-6、NK-9、NK-12、NK-15、NK-19 和NK-22。其中，NK-9 中均為純合突變，且NtJAZ1-1靶位點(diǎn)序列在1587～1641 bp 處缺失55 個(gè)堿基，NtJAZ1-2靶位點(diǎn)序列在1547～1548 bp 缺失2 個(gè)堿基（圖1）。

圖1 NK-9株系的分子鑒定Fig.1 Molecular identification of NK-9 line

為驗(yàn)證NtJAZ1基因敲除對(duì)煙堿合成的影響，采用RT-PCR對(duì)相關(guān)煙堿合成基因進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果如圖2 所示。圖2 表明，與K326 相比，NK-9 中NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的相對(duì)表達(dá)量明顯提高，但NtODC和NtA622的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化。

圖2 NK-9株系相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expressions of genes of NK-9 line

2.2 NtJAZ1 基因敲除對(duì)植物學(xué)性狀及葉面化學(xué)成分的影響

分別對(duì)植株形態(tài)和農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察與調(diào)查，結(jié)果見(jiàn)表2和圖3A。與K326相比，NK-9生長(zhǎng)良好，株高、葉數(shù)和葉寬顯著高于對(duì)照K326，葉長(zhǎng)顯著低于K326，莖圍和節(jié)距差異不顯著。腺毛形態(tài)觀察和密度統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖3B，與K326相比，NK-9腺毛總數(shù)為77.29 根/mm2，降低14.62%，長(zhǎng)柄分泌型腺毛數(shù)量降低20.19%。對(duì)葉面化學(xué)成分分析（圖3C）發(fā)現(xiàn)，NK-9 的葉面化學(xué)成分總量為39.70 μg/cm2，西柏烷類(lèi)二萜含量為34.43 μg/cm2，明顯低于K326，分別降低23.71%和25.32%。這表明NK-9 生長(zhǎng)發(fā)育良好，NtJAZ1具有調(diào)控腺毛發(fā)育和葉面化學(xué)合成分泌的功能。

表2 NK-9株系的農(nóng)藝性狀指標(biāo)①Tab.2 Agronomic trait indexes of NK-9 line

圖3 NK-9株系的田間生長(zhǎng)發(fā)育狀況Fig.3 Growth and development of NK-9 line in fields

2.3 NtJAZ1基因敲除對(duì)煙葉煙堿含量的影響

分別在現(xiàn)蕾期、打頂期和成熟期對(duì)煙葉進(jìn)行煙堿含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。與對(duì)照K326相比，隨著煙株的生長(zhǎng)發(fā)育，NK-9 煙葉煙堿逐漸積累，在現(xiàn)蕾期顯著提高33.26%，在打頂期和成熟期分別極顯著提高36.41%和39.28%。由此可見(jiàn)，NtJAZ1基因敲除后促進(jìn)了煙株中煙堿的合成。

圖4 NK-9株系的煙堿含量Fig.4 Nicotine content of NK-9 line

2.4 NtJAZ1基因敲除對(duì)烤后煙葉化學(xué)成分的影響

2.4.1NtJAZ1基因敲除對(duì)常規(guī)化學(xué)成分的影響

選取C3F 等級(jí)煙葉進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定，結(jié)果（表3）顯示：與對(duì)照K326 相比，NK-9 烤后煙葉煙堿含量提高44.91%，差異達(dá)極顯著水平，氮堿比和糖堿比偏低，總糖、還原糖、總氮、氯和鉀含量在適宜范圍內(nèi)。

表3 烤后煙葉化學(xué)成分含量Tab.3 Contents of chemical components in cured tobacco leaves

2.4.2NtJAZ1基因敲除對(duì)中性香氣成分的影響

對(duì)C3F 等級(jí)煙葉進(jìn)行香氣物質(zhì)含量分析，結(jié)果（表4）顯示：共檢測(cè)出棕色化反應(yīng)產(chǎn)物、類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)降解產(chǎn)物、苯丙氨酸類(lèi)降解產(chǎn)物、西柏烷類(lèi)降解產(chǎn)物和新植二烯五大類(lèi)。

從表4 可以看出，與對(duì)照K326 相比，NK-9 煙葉的新植二烯含量提高35.02%，類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)降解產(chǎn)物含量總體上增加，棕色化反應(yīng)產(chǎn)物總量和西柏烷類(lèi)降解產(chǎn)物含量略有降低，中性香氣物質(zhì)總量略高，達(dá)1060.35 μg/g。說(shuō)明NtJAZ1基因敲除株系中的新植二烯和中性致香物質(zhì)總量明顯提高。

表4 烤后煙葉中性香氣物質(zhì)含量Tab.4 Contents of neutral aroma components in cured tobacco leaves （μg·g-1）

3 討論

本試驗(yàn)中通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)K326 中NtJAZ1基因序列進(jìn)行編輯，導(dǎo)致該基因發(fā)生移碼突變，翻譯提前終止，獲得了NtJAZ1基因敲除材料NK-9。對(duì)NK-9 根系中煙堿合成基因的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控?zé)焿A生物合成基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)不同程度增加，使NK-9株系在現(xiàn)蕾期、打頂期和成熟期的煙葉煙堿含量分別顯著增加33.26%、36.41%和39.28%。這與Zhang 等［12］和Shoji 等［30］的研究結(jié)果一致，這些結(jié)果證明，NtJAZ1基因是煙堿生物合成調(diào)控的重要靶點(diǎn)之一。

在提高煙堿含量的同時(shí)，保證煙株正常的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于煙草品種定向改良至關(guān)重要。本研究中對(duì)NK-9株系的農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NtJAZ1基因失去功能后，基本不影響煙株正常的生長(zhǎng)發(fā)育。雖然葉長(zhǎng)與對(duì)照相比有所減小，但株高、葉數(shù)和葉寬顯著提高，對(duì)煙葉生產(chǎn)并無(wú)嚴(yán)重的不良影響。荊葉醒等［31］在小麥研究中也發(fā)現(xiàn)，小麥TaJAZ1基因編輯后，植株生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好。由此推測(cè)，NtJAZ1基因在應(yīng)答茉莉酸甲酯（MeJA）信號(hào)調(diào)控次生代謝的同時(shí)，其功能缺失并不影響植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育。當(dāng)然，由于煙株發(fā)育受栽培和多種環(huán)境因素的影響，NtJAZ1基因?qū)熤臧l(fā)育的影響還需要多年多點(diǎn)的試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

NtJAZ1基因在調(diào)控?zé)焿A合成的同時(shí)，對(duì)煙葉其他化學(xué)成分也有一定影響。本研究中對(duì)獲得的NK-9 株系烤后煙葉進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NK-9 煙葉中性致香物質(zhì)總量提高，其中新植二烯和類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)降解產(chǎn)物明顯增加，這對(duì)煙葉品質(zhì)有積極影響。但NtJAZ1基因的敲除也導(dǎo)致了煙葉葉面腺毛，尤其是長(zhǎng)柄分泌型腺毛密度的減小，使腺毛分泌物，尤其是類(lèi)西柏烷二萜化合物含量降低，最終導(dǎo)致了烤后煙葉中西柏烷類(lèi)香氣物質(zhì)茄酮含量減少，這對(duì)煙葉品質(zhì)有不利影響。關(guān)于JAZ家族基因調(diào)控腺毛發(fā)育方面，在擬南芥［32］、番茄［33］和青蒿［34］中已有報(bào)道，但NtJAZ1基因調(diào)控?zé)煵菹倜l(fā)育的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。另外，可通過(guò)多性狀聚合途徑，在NtJAZ1敲除的植株上對(duì)腺毛密度進(jìn)行定向改良，在保證煙堿高積累的同時(shí)，促進(jìn)腺毛發(fā)育和分泌物的積累，從而提高煙葉品質(zhì)。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得了NtJAZ1基因敲除的定向改良株系NK-9。田間試驗(yàn)表明，NK-9 株系生長(zhǎng)發(fā)育良好，在現(xiàn)蕾期、打頂期和成熟期中部葉片煙堿含量分別提高33.26%、36.41%和39.28%，烤后煙葉煙堿含量提高44.91%，中性致香物質(zhì)總量顯著增加。這表明NtJAZ1基因敲除能顯著增加煙葉煙堿含量，促進(jìn)煙葉中性致香物質(zhì)的積累，是進(jìn)行煙堿含量定向改良的重要靶點(diǎn)。