煙葉中多菌靈膠體金定量試紙條的研制及應用

李曉芳，周潤鑫，王春瓊，魏力杰，張 燕，李天偉，王兆芹*

1. 北京勤邦生物技術有限公司，北京市昌平區回龍觀國際信息產業基地高新四街8號 1022062. 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京市昌平區回龍觀國際信息產業基地高新四街8號 1022063. 云南省煙草質量監督檢測站，昆明市高新技術產業開發區科醫路41號 650106

多菌靈，化學名稱為苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，是一種廣譜、高效、低毒、內吸性苯并咪唑類殺菌劑，廣泛用于麥類、水稻、棉花、油菜、花生、甘薯、蔬菜、果樹、花卉等植物的病害防治。市場上推廣應用的苯并咪唑類殺菌劑產品主要有多菌靈、苯菌靈和甲基硫菌靈等。根據農業農村部農藥登記資料，甲基硫菌靈為在煙葉上登記使用的農藥，用于煙葉白粉病、根黑腐病的防治［1］。甲基硫菌靈、苯菌靈為不穩定化合物，在植物體內可代謝為多菌靈［2-4］。近年來，多菌靈在煙葉中檢出率較高，給煙葉質量和生產帶來一定的風險。目前，國內外對于多菌靈的分析方法主要有分光光度法［5-6］、超高效液相色譜法［7-8］、高效液相色譜法［9-10］、液相色譜-串聯質譜法［11-13］、拉曼光譜法等［14-15］。上述方法需要在實驗室環境下由專業人員進行操作，樣品前處理繁瑣費時，還需配備昂貴的儀器設備，檢測成本高、耗時長、操作復雜。此外，也有報道利用酶聯免疫法［16］、可視化微陣列蛋白芯片法［17］快速檢測多菌靈的殘留量，但樣品集中在蜂蜜、蔬菜、水果等種類，同時這些方法對實驗人員、環境、儀器設備也有嚴格要求，操作時間在1 h以上，不適用于基層現場快速檢測。相關文獻［1，18-22］中報道的煙葉中多菌靈檢測方法主要是QuEchERS前處理技術與LC-MS/MS 檢測技術相結合的方法，該方法操作復雜，成本高，不能完全滿足我國煙葉質量控制需求。鑒于此，本研究中對膠體金試紙條產品形式進行篩選，在能滿足檢測需求的同時，利用變異系數較小的工藝制備試紙條產品；并配套手持式膠體金讀數儀，繪制標準曲線，形成能現場定量檢測煙葉樣品的商品化試紙條產品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

50個煙葉樣品（2020年產自云南、貴州的中部和下部煙葉）。

1000 μg/mL的多菌靈乙醇溶液（農業農村部環境保護科研檢測所）；苯菌靈、甲基硫菌靈、三唑酮、三唑醇標準品（≥99%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、Triton X-100、羊抗鼠IgG（美國Sigam 公司）；碳酸鉀、聚山梨酯-80、蔗糖、乙醇、甲醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；硝酸纖維素膜（NC膜，德國Sartorius公司）；膠體金溶液、多菌靈單克隆抗體、多菌靈半抗原-OVA 偶聯物（自制）；樣品稀釋液為pH=7.2的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（自制）。

ESJ110-4A電子天平（感量0.0001 g，沈陽龍騰電子有限公司）；TGL16C臺式高速冷凍離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）；XYZ3060 三維噴點平臺（美國Bio-Dot 公司）；CTS300 數控裁條機、ZQ2402微電腦自動斬切機（上海金標生物科技有限公司）；GT710 膠體金讀數儀、KMH-102 恒溫孵育器（北京勤邦生物技術有限公司）；FSJ-A05N6 磨粉機（小熊電器股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多菌靈試紙條產品形式的確定

用膠體金免疫層析技術篩選出適合多菌靈試紙條的NC 膜、抗原抗體稀釋液、金標墊和樣品墊封閉液后，用凍干金配套試紙卡、噴金配套試紙卡兩種工藝制備出試紙條。試紙卡分別以包被原和羊抗鼠IgG作為NC膜上的檢測線（T線）和質控線（C線）［23］，采用劃膜儀進行劃線，兩線相隔5 mm，噴量1 μL/cm，凍干金配套試紙卡、噴金配套試紙卡包被原的質量濃度分別為0.5、0.3 mg/mL，羊抗鼠IgG 的濃度分別為0.6、0.4 mg/mL，將包被好的NC膜置于37 ℃下干燥4 h；噴金配套試紙卡產品用噴膜儀將金標抗體按5 μL/cm的量均勻噴涂在金標墊上，37 ℃下干燥2 h；依次將NC 膜、金標墊、樣品墊、吸水墊粘貼于PVC底板上，貼好后切成4 mm 寬的試紙條，裝在特制的塑料制卡中并置于密封袋內，加干燥劑，密封，室溫保存。基于凍干金配套試紙卡產品，向微孔板中加入50 μL多菌靈單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍干燥機中，冷阱溫度-50 ℃條件下，預凍3 h，真空干燥15 h，即得到凍干有多菌靈單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑，密封4 ℃保存。試紙條制備完成后，往空白煙葉樣品中添加不同質量分數（0、0.09、0.50 mg/kg）的多菌靈標準品，然后進行板內、批內變異系數測試，選擇變異系數最小、同時能滿足檢測范圍需求的產品形式。

1.2.2 多菌靈試紙條檢測溫度的確定

結合現場實驗環境溫度和抗原抗體耐受溫度，選擇室溫（25 ℃）、30 ℃、33 ℃、35 ℃、40 ℃5 個溫度，往空白煙葉樣品中添加不同質量分數的多菌靈標準品，對比試紙條T、C 線比值（T/C 值）［23］的變化，選擇T/C 值梯度較好的反應溫度作為方法檢測溫度。

1.2.3 樣品處理及檢測方法

煙葉去主脈后在60 ℃條件下烘干，利用磨粉機將其粉碎，然后稱取（1.00±0.05）g 樣品，加入5 mL甲醇，振蕩1 min。移取100 μL上清液，再加入900 μL樣品稀釋液，混勻即為待檢液。將恒溫孵育器提前加熱至1.2.2 節確定的溫度，將試紙條插入孵育器卡槽中，移取100 μL待檢液，一次性垂直滴加于加樣孔（S孔）中，反應10 min后，立即用膠體金讀數儀讀取結果。

1.2.4 標準曲線的繪制和定量范圍的確定

按樣品處理及檢測方法測試多菌靈質量分數分別為0、0.020、0.045、0.090、0.15、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0 mg/kg 的煙葉樣品的T/C 值，每個質量分數的樣品平行測試6次，計算平均值，結合儀器定值樣品進行校正，根據校正后對應質量分數樣品的T/C 值繪制標準曲線。對標準曲線線性較好的區間進行曲線擬合，R2大于0.99的線性范圍為定量范圍。

1.2.5 試紙條性能指標的確定

①特異性：分別向空白煙葉樣品中添加其他常見的苯并咪唑類農藥（苯菌靈、甲基硫菌靈、噻菌靈）及三唑酮、三唑醇至質量分數為10 mg/kg，用試紙條進行檢測，每種藥物平行測定2次，根據結果判定試紙條特異性。

②檢測限：利用制備好的多菌靈試紙條檢測20個經過預處理的陰性煙葉樣品，用膠體金讀數儀讀取對應多菌靈的質量分數。計算20個陰性樣品中多菌靈質量分數的平均值和標準差，參照文獻［24］將多菌靈質量分數的平均值+3×標準差作為煙葉樣品中多菌靈的最低檢測限。

③準確性和精密度：取3個不同來源的空白煙葉樣品，分別添加4 個質量分數水平（0.045、0.090、0.180、0.360 mg/kg）的多菌靈標準品，每個水平下用3批次的試紙條分別進行6次平行測試，根據各添加質量分數的實際測定值計算添加回收率和批內變異系數，從而判斷試紙條的準確性和精密度。

④與高效液相色譜- 串聯質譜法（High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測結果對比：隨機選取50個煙葉樣品，分別用多菌靈試紙條和儀器方法進行檢測，確定陽性樣品檢出符合率。儀器檢測方法參照YC/T 405.1—2011［18］的方法進行。

2 結果與討論

2.1 多菌靈試紙條產品形式

由表1 可知，添加的多菌靈質量分數相同時，凍干金配套試紙卡的抑制率高于噴金配套試紙卡，表明凍干金配套試紙卡的靈敏度更高；但噴金配套試紙卡的板內和批內變異系數均小于凍干金配套試紙卡，同時噴金配套試紙卡無需溶解凍干金步驟。因此，選擇噴金配套試紙卡作為多菌靈試紙條的產品形式。

表1 多菌靈試紙條的產品形式Tab.1 Product types of test strips for carbendazim

2.2 多菌靈試紙條檢測溫度

利用膠體金讀數儀，檢測出7個梯度樣品中多菌靈的質量分數。由圖1可知，溫度一定時，隨著多菌靈質量分數的增加，T/C 值呈下降趨勢，原因是多菌靈檢測試紙條應用了競爭抑制免疫層析的原理，樣品中的多菌靈在流動過程中與膠體金標記的特異性單克隆抗體結合，抑制了抗體和NC膜檢測線（T線）上的多菌靈-BSA偶聯物的結合，從而導致檢測線顏色發生變化。對于多菌靈質量分數相同的樣品，T/C值隨溫度升高而增大，其中，40 ℃時，空白樣品與多菌靈質量分數為2.000 mg/kg的樣品的梯度最大，線性范圍最好，更有利于后續標準曲線的繪制。因此，最終選擇40 ℃為多菌靈試紙條的檢測溫度。

圖1 不同檢測溫度和多菌靈質量分數下試紙條T/C值的變化Fig.1 Variations of T/C value of test strip at different detection temperatures and carbendazim mass fractions

2.3 標準曲線和定量范圍

當空白煙葉樣品中添加多菌靈質量分數分別為0、0.020、0.045、0.090、0.15、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0 mg/kg的多菌靈標準品時，對比利用多菌靈試紙條測試的T/C 值結果與儀器定值樣品結果，確定最終10個質量分數水平的樣品的T/C 值，然后以多菌靈的質量分數為橫軸，T/C值為縱軸，繪制標準曲線，如圖2 所示。取曲線中線性范圍較好區間（0.020～0.50 mg/kg）進行曲線擬合，如圖3 所示，回歸方程為y=0.721lnx+0.273，R2=0.999。因此，確定該方法的定量范圍為0.020～0.50 mg/kg。

圖2 膠體金試紙條的標準曲線Fig.2 Standard curve of colloidal gold test strip

圖3 多菌靈質量分數為0.020～0.50 mg·kg-1范圍內的擬合標準曲線Fig.3 Fitting standard curve of carbendazim in the mass fraction range of 0.020-0.50 mg·kg-1

2.4 多菌靈試紙條性能指標

2.4.1 特異性

由表2可知，利用多菌靈試紙條檢測與多菌靈具有類似功能或結構的農藥時，如苯菌靈、甲基硫菌靈等，檢測結果均為陰性，表明該試紙條與其他苯并咪唑類殺菌劑和三唑類藥物無交叉反應，具有較好的特異性。

表2 多菌靈試紙條的特異性結果Tab.2 Specific results of test strip for carbendazim

2.4.2 檢測限

利用制備好的多菌靈試紙條測定20個陰性煙葉樣品，檢測結果見表3。20個陰性樣品對應的多菌靈質量分數的平均值為0.005 mg/kg，標準差為0.004 mg/kg。根據1.2.5 節中最低檢測限的定義可知，對于本研究中制備的試紙條，煙葉樣品中多菌靈的最低檢測限為0.017 mg/kg。

表3 陰性樣品中多菌靈質量分數的測定結果Tab.3 Mass fractions of carbendazim in negative samples

2.4.3 準確性和精密度

向空白煙葉樣品中添加多菌靈標準品至質量分數為0.045、0.090、0.180、0.360 mg/kg 4個水平，每個質量分數對應的樣品用3 批次的試紙條分別進行6次平行測試，結果見表4。可見，多菌靈試紙條定量檢測方法的加標回收率范圍為95.6%～128.9%，批內變異系數范圍為6.2%～11.2%，均符合檢測方法要求。

表4 多菌靈試紙條檢測的準確性和精密度結果（n=6）Tab.4 Accuracy and precision of test strip for carbendazim（n=6）

2.4.4 與儀器方法檢測結果對比

檢測的50 個煙葉樣品中，儀器檢測結果為陰性的樣品有30個。其中，對應的試紙條檢測結果中有29 個均小于試紙條檢測限，也為陰性；僅46號樣品的檢測結果（0.032 mg/kg）大于檢測限，說明試紙條檢測有一定的假陽性，陰性樣品檢測結果準確率大于95%。在煙葉生產加工過程中，需要用不同原料混合配料；同時在檢測過程中，需要對待檢樣品進行抽樣、去主脈粉碎后檢測，樣品的取樣代表性和均一性對檢測結果影響較大。因此，為了降低假陰性，快速檢測方法允許有一定的假陽性。

20 個陽性樣品的試紙條檢測結果和儀器檢測結果如表5 所示，相對偏差在3.00%～48.59%之間，對兩種檢測結果的相關性分析如圖4所示。試紙條檢測結果與HPLC-MS/MS 檢測結果的線性方程為y=0.8351x+0.0460，相關系數R=0.8456；在定量范圍0.020～0.50 mg/kg 內的線性方程為y=0.9128x+0.0068，相關系數R=0.9604。結果表明，多菌靈試紙條的檢測結果與HPLC-MS/MS 檢測結果在定量范圍內線性關系良好，可以應用于煙葉中多菌靈的檢測篩選工作。

表5 試紙條與HPLC-MS/MS檢測實際煙葉樣品中多菌靈質量分數的結果①Tab.5 Test results of mass fractions of carbendazim in tobacco leaves by test strip and HPLC-MS/MS（mg·kg-1）

圖4 試紙條與HPLC-MS/MS法檢測煙葉中多菌靈的相關性結果Fig.4 Correlation between test results of test strip and HPLC-MS/MS for carbendazim in tobacco

在實際檢測工作中，取樣代表性、樣品粉碎程度和含水率等會影響檢測結果，為了更好地提高煙葉中多菌靈的檢測結果準確率，建議從生產、流通環節加強質量監管，將合格品和不合格品進行分類管理。

3 結論

用膠體金免疫層析技術并配套膠體金讀數儀，建立了能有效檢測煙葉中殘留的多菌靈藥物的快速定量檢測方法。①研制的多菌靈定量試紙條的檢測限為0.017 mg/kg，檢測范圍為0.020～2.0 mg/kg，定量范圍為0.020～0.50 mg/kg，加標回收率為95.6%～128.9%，批內變異系數為6.2%～11.2%；與HPLC-MS/MS 檢測結果相比，陰性樣品檢測結果準確率大于95%，陽性樣品檢測結果在定量范圍0.020～0.50 mg/kg內線性關系良好。②對于與多菌靈結構相似的藥物，試紙條與其無交叉反應，可特異性地定量檢測煙葉中多菌靈殘留的質量分數。