丹白顆粒對子宮內膜異位癥大鼠異位癥血管生成及應激水平的影響

姜艷玲，王金華*，李發余，徐善榮，郭海龍

（1.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；2.福建醫科大學附屬第一醫院婦科，福建 福州 350005；3.日照市人民醫院婦科，山東 日照 276826）

子宮內膜異位癥（endometriosis, EMT）是育齡婦女的常見病，發病率高達10%～15%，經期子宮內膜碎片隨經血逆流，通過輸卵管種植于卵巢和鄰近的盆腔腹膜，隨后在種植處繼續生長和蔓延，異位病灶組織的生長均有侵襲、局部播散、轉移以及復發等諸多方面的特征，最終EMT 形成[1-2]。 據研究，EMT是否發病與激素水平密切相關[3]；另有研究發現，氧化應激反應及異位內膜病灶血管生成在EMT 的發生發展中起到重要作用，EMT 患者血清中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）水平明顯升高，血管生成是EMT 種植生長維持的必要條件，VEGF 水平越高則表明促血管生成作用越強[4]。 異位內膜組織病灶處的血管異常增生及炎性反應是EMT 的主要致病基礎，抑制血管生成對EMT 的治療至關重要[5]。目前，EMT 主要依靠手術或藥物進行治療，而中醫學在該病的治療方面有著獨特的優勢。 大量研究表明，中醫藥的有效干預能夠顯著抑制異位病灶的生長，并能有效改善患者臨床癥狀[6]。本研究通過動物實驗，探討丹白顆粒對EMT 大鼠異位內膜組織中血管生成和應激反應的影響[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取48 只SD 大鼠雌性，性成熟，無交配記錄，體質量200～240 g，購自北京華阜康有限公司動物研究中心，8～9 周齡，許可證號為SYXK（京）2021-0015，使用許可證號：SYXK（魯）2018-008，倫理批準編號：NH-IACUC-2021-022，所有大鼠均飼養在中藥制藥共性技術國家重點實驗室動物房中，溫度25 ℃，相對濕度50%，保持環境安靜、干凈、透氣，12 h/12 h 間斷光照，自由飲食、飲水，定期更換墊料，清潔、消毒鼠籠。

1.1.2 主要儀器與試劑 離心機（H2050R，湘儀離心機儀器有限公司）；石蠟切片機（TYJ10，紹興譜爾儀器設備有限公司）；顯微鏡（E100，尼康公司）；酶標儀（SHE-3000，北京賽爾福公司）。 孕三烯酮膠囊（國藥準字H19980020，2.5 mg/粒，華潤紫竹藥業有限公司，生產批號00321081）；丹白顆粒（國藥準字Z20090651，8 g/袋，山東新時代藥業有限公司，生產批號2111222）；VEGF 檢測試劑盒購自北京興康生物科技有限公司；測定促卵泡生成素（follicle stimulating hormone, FSH，批號：140625-201411）、促黃體生成素（luteinizing hormone, LH，批號：120903-201510）、孕酮（proges-terone, P，批號：111826-201806）試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD，批號：111854-201905）、丙二醛（malondialdehyde,MDA，批號：121038-201405）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSHPx，批號：100533-201805）檢測試劑盒由北京生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 按SPF 級動物要求飼養，采用戊酸雌二醇灌胃使大鼠處于統一動情期，選擇動情周期4～5 d、有連續2 個正常動情周期的大鼠，適應性喂養1 周開始造模。 稱量大鼠體質量，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液（劑量為45 mg/kg）進行麻醉，給藥劑量為0.3 mL/kg，將大鼠仰臥位固定至鼠板，剪開腹壁，剪取部分子宮內膜組織，用縫合針把內膜縫合于腹壁上，關腹縫合。術后連續3 d 給予青霉素鈉腹腔注射預防感染，術后10 d 開始進行戊酸雌二醇（0.2 mg/只）灌胃，連續5 d。 手術后4 周，選擇動情期大鼠再次麻醉，開腹觀察，異位病灶體積增大，有血管增生或水腫病變，呈小囊狀或透明結節狀，內含清亮液體，表面有血管形成和結締組織覆蓋，可以認定為造模成功[8]。

1.2.2 分組與給藥 取造模成功大鼠40 只，隨機編號并染色標記，采用隨機數字表法分為模型組、陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8 只。 另取8 只大鼠僅開腹剪開子宮后縫合，設為假手術組。造模成功后，陽性藥組：孕三烯酮膠囊灌胃給藥，取膠囊內容物與適量的蒸餾水混合研磨溶化，每次按0.5 mg/kg 灌胃，每周2 次；低劑量組、中劑量組、高劑量組：丹白顆粒灌胃給藥，給藥方法參照說明書中人用劑量進行大鼠實驗劑量換算，低劑量組為70 mg/kg，中劑量組為135 mg/kg，高劑量組為200 mg/kg，用蒸餾水配制成指定濃度的丹白顆粒溶液，劑量為0.5 mL/只，每天給藥3 次，連續給藥2 周；假手術組和模型組給予等體積的蒸餾水，灌胃治療過程中，觀察大鼠生理狀態、精神狀態等情況；末次給藥后每組大鼠均給予2 U 縮宮素，觀察大鼠痛經狀況，隨后常規麻醉頸椎脫臼處死大鼠，剖取異位子宮內膜組織，部分使用組織固定液固定以制備病理切片，剩余組織于低溫冰箱（-80 ℃）凍存。

1.2.3 指標測定 （1）標本采集及測量：末次給藥24 h 后，吸入乙醚麻醉大鼠后處死，開腹觀察各組大鼠異位子宮內膜生長情況，測量在位內膜厚度，采用游標卡尺測量異位組織體積大小并稱重，保存備用；腹主動脈取血約5 mL，靜置后離心（3 000 r/min，15 min，r=10 cm），收集上清液，低溫（-80 ℃）保存備用；解剖取出子宮，剝離假手術組正常子宮內膜組織和其余組異位子宮內膜組織，漂洗后分成兩部分，一部分用10%甲醛固定，HE 染色，切片，通過顯微鏡進行病理組織學檢查；剩余部分各剪取約0.5 g凍存在液氮中備用。

（2）血管生成相關指標檢測：采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA）檢測大鼠血清中VEGF 含量， 取血清置于冰水浴中解凍，采用ELISA 法檢測其中VEGF 水平，具體操作參照各自說明書的步驟進行。

（3）大鼠異位子宮內膜組織微血管密度（microvessel density, MVD）檢測：找出各組子宮異位內膜組織中微血管最密集的部位進行觀察并記錄，結果以3 個200 倍視野下血管數目的平均數來表示，在內膜組織中與鄰近微血管、腺體組織分界清楚的任何一個染成棕色的細胞或細胞叢均被認為是1 個新生血管[8]。

（4）相關因子水平檢測：采用ELISA 法測定異位子宮內膜組織相關因子水平含量，取部分異位子宮內膜組織于離心管中，加入0.9%氯化鈉溶液0.9 mL制備組織勻漿液，嚴格按照ELISA 試劑盒的操作說明測定各組異位子宮內膜組織中FSH、LH 水平。 采用放射免疫法檢測E2、P 含量。

（5）氧化應激指標水平檢測：取部分異位子宮內膜組織，低溫研磨制備組織勻漿，嚴格按照各試劑盒的說明書測定異位子宮內膜組織中的SOD、MDA、GSH-Px 水平。

1.3 統計學分析

采用EXCEL 與SPSS 20.0 進行數據處理與分析，計量數據用以“±s”表示，進行正態性檢驗，多組獨立、正態、方差齊資料組間比較采用單方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜組織比較

假手術組無異位組織生長，模型組、陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組均有異位組織生長。與模型組相比，陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的異位組織體積、異位組織重量、在位內膜厚度降低（P＜0.05）；與陽性藥組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的異位組織體積、異位組織重量、在位內膜厚度升高（P＜0.05）。 詳見表1。

表1 子宮內膜組織檢測結果（n=8）

2.2 內膜組織病理觀察

假手術組大鼠內膜組織上皮細胞排列整齊，界限清晰，間質細胞排列均勻；模型組大鼠異位病灶較厚，內膜組織上皮細胞呈矮柱狀，腺體形態改變明顯，細胞間質增多，細胞間隙變小，大量炎癥細胞浸潤、大量腺體、組織增生；陽性藥組與丹白顆粒不同劑量組大鼠異位內膜均受到不同程度的抑制，大鼠異位病灶明顯變薄，炎癥細胞浸潤、組織增生及血液供應不同程度減少。 詳見圖1。

圖1 各組內膜組織病理觀察

2.3 血管生成相關指標比較

與假手術組比較，模型組大鼠VEGF、MVD 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的VEGF、MVD 水平降低（P＜0.05），其中高劑量組與陽性藥組大鼠VEGF、MVD 水平趨近于假手術組。 詳見表2、圖2。

圖2 各組內膜組織MVD（×100）

表2 各組異位子宮內膜組織VEGF、MVD 表達水平（n=8）

2.4 相關因子水平比較

與假手術組比較，模型組大鼠FSH、LH、E2 表達水平升高，P 表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠FSH、LH、E2 表達水平較低，P 表達水平升高（P＜0.05）。與陽性藥組比較，模型組與低中劑量組的FSH、LH、E2 表達水平高，同時P 表達水平低（P＜0.05），高劑量組的FSH、LH、E2 表達水平與陽性藥組接近，P高于陽性藥組（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠異位子宮內膜組織相關因子水平檢測結果比較（n=8）

2.5 氧化應激指標水平比較

與假手術組比較，模型組大鼠SOD、GSH-Px 表達水平降低，MDA 表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠SOD、GSH-Px 表達水平升高，MDA 表達水平降低（P＜0.05）。與陽性藥組比較，模型組與低劑量組的SOD、GSH-Px 表達水平低，同時MDA 表達水平高（P＜0.05），中高劑量組的SOD、MDA 表達水平與陽性藥組接近，中劑量組的GSH-Px 低于陽性藥組，高劑量組的GSH-Px 高于陽性藥組（P＜0.05）。 詳見表4。

表4 各組大鼠異位子宮內膜組織SOD、MDA、GSH-Px 表達水平比較（n=8）

3 討論

EMT 是具有生長功能的子宮內膜組織出現在宮腔被覆黏膜以外其他部位的雌激素依賴性疾病，在育齡婦女中發病率約為10%，嚴重影響女性的生殖健康和生活質量[8]。 子宮內膜受多種內分泌激素調節，激素分泌失衡參與子宮內膜癥的發生和發展，異位子宮內膜的異位過程可概括為：黏附→侵襲→血管形成，血管內皮細胞進行侵襲過程中，可以通過釋放細胞因子、蛋白水解酶等物質，增加內膜細胞在異位組織上的侵襲能力，促進異位內皮細胞在異位組織的增殖生長[9]。 EMT 患者存在免疫缺陷、侵襲、血管生成等內膜微環境改變，而各種信號通路可通過調控體內酶及細胞因子的表達，進而影響異位內膜的黏附、侵襲、血管生成及凋亡，參與EMT 的發生、發展過程[10-11]。

現代中醫認為，“陽虛寒凝，沖任、胞宮氣血不暢，瘀血內阻”可導致瘀血阻滯，臨床治療以活血化瘀散結為主，女子易胞宮虛寒，氣血不暢，經血瘀滯，以溫經散寒、養血和營、化瘀止痛為治法[12-13]。 丹白顆粒由牡丹皮、大血藤、紫花地丁、三棱、莪術、敗醬草、白英、白花蛇舌草、川芎、白芍、土茯苓、墓頭回、椿皮、當歸14 味中藥組成，具有清熱化瘀、祛濕止痛的功效；本方以中醫臨床辨證論治為核心，牡丹皮清熱涼血、活血散瘀，大血藤敗毒消癰、活血通絡、祛風殺蟲，紫花地丁清熱解毒、涼血消腫，三藥合用，共奏清熱化瘀、祛濕止痛之效，共為君藥；三棱苦降辛開，平而不烈，性非猛而建功甚速，配莪術行氣破血、消積止痛，且兩者均入肝、脾經，可消肝郁之積、理脾虛之滯，敗醬草乃手足陽明厥陰藥也，善排膿破血，川芎辛溫，走而不守，行氣開郁，活血止痛，可“上行頭目，下行血海”，4 味中藥行滯活血、化瘀止痛，為臣藥共滌瘀滯以通脈止痛；白英、白花蛇舌草、川芎、白芍、土茯苓、墓頭回、椿皮合用以清熱解毒利濕、固澀止帶，為佐藥；當歸味甘辛，溫而不燥，行而不猛，甘緩調和，能引諸藥入沖任，調經血，用之為使；本方君臣佐使俱全，組方合理，用藥精當，共奏活血化瘀、祛濕止痛之功。

上述研究中，丹白顆粒可以抑制子宮異位內膜組織的生長，降低異位子宮內膜的體積和重量，并通過抑制VEGF 蛋白的表達，抑制新生血管生成，降低異位子宮內膜組織的MDV；對EMT 大鼠高水平的FSH 和LH 均有抑制作用，降低血清E2 水平，升高P 水平，降低外周血中激素水平，調節內分泌系統的紊亂，高劑量組使其趨于正常水平；調節機體免疫失調和氧化還原失衡，抑制EMT 大鼠血清中MDA 等應激因子的積累，使其趨于正常水平。上述研究從動物實驗的角度證實丹白顆粒可以降低大鼠血清氧化應激水平，表明丹白顆粒可能是通過某種炎性通路影響EM 的發展，但仍未闡明其具體的機制，在下一步的研究中，我們擬探明丹白顆粒治療EMT 的具體信號通路機制，為其在EMT 中的臨床應用提供理論支持。 綜上所述，不同劑量丹白顆粒對EMT 具有不同程度的改善作用，其機制主要通過調節激素的分泌和抑制過氧化物的積累發揮作用，丹白顆粒具有抗炎和抗氧化作用，通過調節炎癥反應和氧化應激反應起到抑制異位內膜黏附、血管生成的作用，從而緩解EMT 病情的發展。