基于GEO 基因芯片結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究火把花根片治療IgA 腎病的作用機(jī)制

秦蘇楊，任秋安,王耀光*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193）

IgA 腎病（IgA nephropathy, IgAN）是世界范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球疾病， 其特征是循環(huán)免疫球蛋白A（immunoglobulin A, IgA）和腎系膜IgA 沉積異常[1-2]。 臨床中，其主要表現(xiàn)為無癥狀血尿（如肉眼血尿、鏡下血尿有或無伴隨蛋白尿）、進(jìn)行性腎病（蛋白尿無伴隨血尿、腎病綜合征），嚴(yán)重者甚至伴隨進(jìn)行性腎衰竭。 不良預(yù)后相關(guān)因素包括高血壓、蛋白尿、表皮生長因子受體降低，發(fā)病人群以成年人為主[3]。目前，IgAN 的西醫(yī)治療藥物以激素以及免疫抑制劑等為主，同時還可通過改善患者生活方式、控制血壓、行扁桃體切除術(shù)等進(jìn)行支持治療。 但激素與免疫抑制劑的價格及不良反應(yīng)均在一定程度上加重患者的負(fù)擔(dān)[4]，因此，利用中醫(yī)藥優(yōu)勢尋找替代療法顯得尤為必要。

IgAN 在中醫(yī)學(xué)屬于“水腫”“腎風(fēng)”“血尿”“腎著”等范疇，以伏邪、瘀血等理論進(jìn)行辨證論治，臨床常用雷公藤、黃葵及類屬中成藥[5-7]。火把花根片(HBHGT)是由昆明山海棠根加工而成，目前已證實HBHGT具有良好的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[8]。 有臨床證據(jù)表明，HBHGT 可緩解炎癥、減少尿蛋白、延緩IgAN 進(jìn)展，且其具有無生物毒性的優(yōu)點(diǎn)[9-11]。 但其治療IgAN的作用機(jī)制尚未十分明確，本文通過生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)手段， 預(yù)測潛在作用靶點(diǎn)和信號通路，以期明確作用機(jī)制，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 IgAN 的基因芯片及差異分析

在NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）以“IgA Nephropathy”為關(guān)鍵詞檢索IgA腎病樣本。 選取含IgAN 樣本與正常樣本的數(shù)據(jù)集5 組（GSE37460、GSE93798、GSE35489、GSE104948、GSE99340）為研究對象。通過R 4.1.2 進(jìn)行系統(tǒng)分析并利用normalize 函數(shù)進(jìn)行歸一化處理。 用Limma包篩選出差異基因，篩選條件為：logFC 絕對值>1，P<0.05 且校正P<0.05。

1.2 HBHGT 成分和靶點(diǎn)篩選

在TCMSP（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）、本草組鑒（http://herb.ac.cn）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）查找HBHGT 的化學(xué)成分，并利用CNKI、PubMed 等數(shù)據(jù)庫檢索近十年（2011-2021 年）有關(guān)HBHGT 成分研究的文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充[12-14]，通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫檢索其分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入SwissADME（http://www.swissadme.ch/index.php），通過Linpinski 五規(guī)則[15]進(jìn)行篩選，最后運(yùn)用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，通過UniProt(https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將獲取的靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范。

1.3 疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫建立

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、Drugback（https://go.drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫以“IgA Nephropathy”為關(guān)鍵詞，檢索IgAN 的靶點(diǎn)，整合后與“1.1”項中從GEO 數(shù)據(jù)庫獲得的差異基因取交集，建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.4 HBHGT 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物與疾病二者靶點(diǎn)取交集，得到HBHGT治療IgAN 的潛在靶點(diǎn)。 運(yùn)用Cytoscape 3.8.0 構(gòu)建HBHGT 治療IgAN 的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，利用工具NetworkAnalyzer 分析成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度、介度及緊密度等[16]，從而得出發(fā)揮藥效的主要成分。

1.5 核心靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將潛在靶點(diǎn)輸入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)進(jìn)行PPI 分析，其中最小互相作用閾值設(shè)為“highest confidence”（>0.9），生物種類設(shè)為“Homo sapiens”。 利用Cytoscape 3.8.0 軟件的CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的連接度中心性（degree centrality, DC）、介度中心性（betweenness centrality,BC）、緊密度中心性（closeness centrality, CC）進(jìn)行計算，并可視化呈現(xiàn)。

1.6 GO 與KEGG 富集分析

將潛在靶點(diǎn)錄入注釋可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（database for annotation visualization and integrated discovery, DAVID），設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行GO 注釋和KEGG 富集分析，并用R 4.1.2 可視化呈現(xiàn)。

1.7 成分-靶點(diǎn)分子對接

將核心成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行對接。 通過ZINC（http://zinc.docking.org）數(shù)據(jù)庫、PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫分別查找核心成分和核心靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Auto Dock 4.2.6 逐一進(jìn)行對接，根據(jù)Docking Score 值評價靶點(diǎn)與活性化合物的結(jié)合強(qiáng)度與活性[17]，再利用Pymol 2.5.0 軟件對對接結(jié)果進(jìn)行分析及繪圖。

2 結(jié)果

2.1 IgAN 差異基因分析

GEO 數(shù)據(jù)集GSE37460、GSE93798、GSE35489、GSE104948、GSE99340 篩選后分別確定了170 個、347 個、80 個、182 個、295 個與IgAN 相關(guān)的差異基因，合并后為723 個。

2.2 HBHGT 成分和靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)共獲得114 個化學(xué)成分，篩選后得到HBHGT 的活性成分共15 個（見表1），通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫共獲得1010個潛在靶點(diǎn)，去重后得到511 個潛在靶點(diǎn)。

表1 火把花根片主要成分

續(xù)表1

2.3 疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫建立

獲得與IgAN 相關(guān)的靶點(diǎn)基因1326 個，與從GEO數(shù)據(jù)庫獲得的723 個差異基因取交集進(jìn)行驗證，獲得402 個疾病靶點(diǎn)。

2.4 HBHGT 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

取交集后得到HBHGT 治療IgAN 的潛在靶點(diǎn)108 個（見圖1）。 運(yùn)用Cytoscape 3.8.0 構(gòu)建HBHGT治療IgAN 的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。通過NetworkAnalyzer 分析成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)，預(yù)測HBHGT 治療IgAN 的主要成分（見表2）。

表2 火把花根片成分部分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

圖1 HBHGRT-IgAN 靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 HBHGT 治療IgAN 的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 核心靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將二者交集靶點(diǎn)在STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果為靶點(diǎn)108 個，靶點(diǎn)之間相互關(guān)系973 條。 利用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)參數(shù)進(jìn)行計算，以DC≥17（中位數(shù)）、BC≥0.001 032 69（中位數(shù)）、CC≥0.135 732 4（中位數(shù)）為條件進(jìn)行篩選，篩選后得靶點(diǎn)54 個，靶點(diǎn)間相互關(guān)系331 條，并用Cytoscape 3.8.0 可視化呈現(xiàn)（見圖3）。其中，DC 值排名靠前的靶點(diǎn)白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、纖維連接蛋白1(fibronectin1, FN1)、白蛋白（albumin,ALB）細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53,TP53）、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、Toll 樣受體(toll-like receptor, TLR)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen activated protein kinase 3, MAPK3）等，即為HBHGT 治療IgAN的可能潛在作用靶點(diǎn)。

圖3 HBHGT 治療IgAN 的核心靶點(diǎn)

2.6 數(shù)據(jù)分析

將HBHGT 治療IgAN 的54 個靶點(diǎn)錄入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，包括GO 的生物學(xué)過程（biological process, BP）、細(xì)胞組成（cellular component,CC）和分子功能(molecular function, MF）分析和KEGG 通路富集分析（見圖4）。 在細(xì)胞組成上富集到了42 個項目，涉及細(xì)胞器、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體外膜等方面；在分子功能上富集到55 個項目，主要與酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性等有關(guān)；參與了128 種生物過程，主要涉及代謝調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、上皮細(xì)胞增殖和凋亡等方面；主要通路有核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號通路、TNF 信號通路、 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothe lial growth factor, VEGF) 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信號通路、TLR信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路等。

圖4 HBHGT 治療IgAN 核心靶點(diǎn)的富集分析

2.7 分子對接驗證

利用AutoDock 軟件將排名前6 的化合物（雷公藤紅素、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、沒食子酸、雷酚內(nèi)脂、雷公藤乙素），與8 種排名靠前的核心靶點(diǎn)(IL6、FN1、ALB、TP53、TNF、TLR、VEGFA、MAPK3)逐一對接，對接結(jié)果只取最高絕對值。 用R 4.1.2 繪制熱圖（見圖5），結(jié)合能絕對值越大表明靶點(diǎn)與活性成分之間的對接結(jié)果越好。 同時，借助Pymol 2.5.0 軟件分別對分值較高的組合進(jìn)行結(jié)合模式分析，詳見圖6。

圖5 HBHGT 中的關(guān)鍵化合物與PPI 核心靶蛋白分子對接Docking Score 值熱圖

圖6 HBHGT 關(guān)鍵化合物與核心靶點(diǎn)對接模型及位點(diǎn)圖

3 討論

火把花根即中藥昆明山海棠根，有祛風(fēng)除濕、活血止血、舒筋接骨、解毒殺蟲等功效。 現(xiàn)代臨床研究表明，其成分具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等作用[18]。李夏玉等[11]對HBHGT 治療的60 例IgAN 病例進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示其有效率為75%，與雷公藤多苷片相比，具有“低毒”的優(yōu)勢；于梅等[19]發(fā)現(xiàn)益腎湯加HBHGT 療效與IgAN 病理類型有關(guān), 病理損害越重療效越差， 且療效較單用其中一種治療IgAN 療效明顯，并且見效快，可減少復(fù)發(fā)。王坤明等[10]研究表明，采用HBHGT 結(jié)合西醫(yī)治療在減少24 h 尿蛋白定量和尿紅細(xì)胞計數(shù)方面優(yōu)于單純西醫(yī)療法，HBHGT 治療IgAN 有效，并具有免疫抑制作用。

在本研究中，通過TCMSP、本草組鑒、BATMANTCM3 個中藥數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)， 利用Linpinski五規(guī)則篩選后得出15 種成分。其中，4 種成分（雷公藤紅素、雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯，雷公藤內(nèi)脂酮）在實驗中進(jìn)行了測試。為了探究HBHGT 治療IgAN 的內(nèi)在機(jī)制，應(yīng)用DAVID 平臺進(jìn)行GO 注釋。 GO 分析表明，HBHGT 治療IgAN 在分子功能方面，主要涉及酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性等方面的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞因子活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等；在細(xì)胞組成方面，涉及細(xì)胞器、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體外膜等方面；在生物學(xué)過程方面，主要涉及代謝調(diào)控和蛋白質(zhì)磷酸化、上皮細(xì)胞增殖和凋亡等方面，如細(xì)胞增殖、凋亡過程、蛋白質(zhì)磷酸化、活性氧代謝等。

FN1 是一種黏附的高分子量二聚糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的一部分。 不同的FN1 變體在二聚體分泌、血液凝固、黏附淋巴細(xì)胞、皮膚傷口愈合、動脈粥樣硬化和肝纖維化中起特定作用[20]。有研究表明，纖維連接蛋白腎病（glomerulopathy with fibronectin deposits, GFND）伴有大量FN1 腎小球沉積，導(dǎo)致終末期腎衰竭[21]。 此外，尿FN1 排泄可能是IgAN 中疾病活動度的標(biāo)志物[22]。原發(fā)性IgAN 患者的血清中存在IgA-FN1 復(fù)合物，IgA 抗體與膠原Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ結(jié)合需要通過FN1 結(jié)合位點(diǎn)來介導(dǎo)[23]。 ALB 是血管內(nèi)主要的抗氧化劑，實驗表明，ALB 預(yù)處理的小鼠系膜細(xì)胞和人腎細(xì)胞中過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體損傷明顯減輕，ALB 的抗氧化能力可以減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而延緩IgAN 的進(jìn)程[24]。

TLR 是哺乳動物固有免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，通過結(jié)合病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern, PAMP）和/或損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular pattern, DAMP）介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)[25]，SMITH[26]印證了TLR 與IgA的發(fā)病有關(guān)。 干擾素、TNF 和特異性白細(xì)胞介素由TLR 誘導(dǎo)。 例如，TNF-α、IL-6、IL-23 和IL-10 的表達(dá)是由TLR4 激活誘導(dǎo)的[27]。 IL-6、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（activator of transcription 3, STAT3）以及NF-κB 通路與TLR2 刺激的IL-17 和IL-23 有關(guān)[28]。NF-κB 信號通路控制一系列基因的表達(dá)（如TNFα、IL-6 的產(chǎn)生），在控制炎癥和免疫反應(yīng)的過程中扮演關(guān)鍵角色[29-30]。

Tp53 在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的不同方面（包括自噬）中起著關(guān)鍵作用。 在正常生理條件下，Tp53 可以抑制自噬體的形成，但應(yīng)激條件也可以導(dǎo)致Tp53 介導(dǎo)的自噬促進(jìn)，在營養(yǎng)耗盡或缺氧等壓力條件下，Tp53 通過抑制mTOR 信號傳導(dǎo)促進(jìn)自噬激活[31]。VEGFA 對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化影響最大，是最主要的VEGF。 VEGF 可以增加血管通透性，參與腎臟血管生成。 研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 在活動性IgAN 組織的上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，推測VEGF 在活動性炎性組織中表達(dá)增強(qiáng)，影響微循環(huán)，加重黏膜缺氧損傷[32-33]。有研究表明，IgAN 患者血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高[34]。TNF-α 是細(xì)胞凋亡、免疫和炎癥的主要介質(zhì)，通過與TNF 受體（TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ）結(jié)合來傳遞其信號[27]。

IgA 的異常糖基化是IgAN 發(fā)病機(jī)制的核心。IgAN患者的腎小球IgA 僅限于IgA1 亞類，例如：半乳糖缺乏性IgA1（galactose-deficient IgA1, Gd-IgA1）[35-36]。IgA1在IgAN 的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，通過TLR9 的先天性免疫激活參與Gd-IgA1 的產(chǎn)生。增殖誘導(dǎo)配體（a proliferation inducing ligand, APRIL）和IL-6 也可增強(qiáng)IgAN 中Gd-IgA1 的合成[37]。此外，IgAN 患者血清中Gd-IgA1 和含有Gd-IgA1 特異性自身抗體的免疫復(fù)合物水平升高[38-39]。 IL-6 和IL-4增加IgA1 的產(chǎn)生，并加重了半乳糖缺乏的程度，增加IgAN 患者分泌IgA1 的細(xì)胞系合成Gd-IgA1[40]。 這些也再次說明，IL-6 可能是這一過程的關(guān)鍵介體。

有動物實驗表明，雷公藤紅素能夠抑制腎臟氧化應(yīng)激和炎癥，降低尿白蛋白排泄和改善糖尿病小鼠的腎臟功能，降低IL-6 和TNF-α 的表達(dá)[41]。 通過抑制NF-κB 信號激活，抑制腎小管細(xì)胞凋亡，從而改善腎臟的炎癥損傷，改善細(xì)胞凋亡[42-43]。 雷公藤紅素可以通過抑制p38 MAPK 表達(dá)和NF-κB p65 降低血肌酐和尿素氮含量，降低糖尿病大鼠尿蛋白的排泄，改善腎臟的病理損傷，調(diào)節(jié)信號通路MAPK/NF-κB，抑制炎癥和延緩腎功能損傷，保護(hù)糖尿病大鼠的腎臟[44]。 作為一個潛在的治療藥物，也可以通過PI3K/AKT 途徑減弱腎損傷，抑制腎小球基底膜增厚和足細(xì)胞凋亡[45]。這些結(jié)果都證實，雷公藤紅素的抗炎效果。

雷公藤甲素具有抗炎、抗增殖、免疫抑制和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[46-48]。 HE 等[49]從IgAN 大鼠的實驗中觀察到，雷公藤甲素可顯著降低血清IL-1β和IL-18 水平，并可能通過下調(diào)NLRP3 和TLR4 的表達(dá)，改善炎癥小體介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來發(fā)揮抗炎作用，阻止IgAN 的進(jìn)展，顯著減弱大鼠腎系膜增生和系膜擴(kuò)張以及腎小球IgA 沉積。 雷公藤甲素可通過減少TNF-α 的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用[50]。TAO 等[51]實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過雷酚內(nèi)酯治療的小鼠與溶媒組的小鼠相比，蛋白尿和尿素氮水平顯著降低，在44 周齡時，溶媒組小鼠的存活率明顯低于用雷公藤甲素或雷酚內(nèi)酯治療的小鼠。

雷公藤內(nèi)酯酮具有抗炎及免疫抑制作用。張建偉等[52]證實大劑量的雷公藤內(nèi)酯酮對T 細(xì)胞增殖反應(yīng)有一定的免疫抑制作用，對B 細(xì)胞的免疫功能有促進(jìn)作用。同時有基礎(chǔ)研究表明，其可顯著降低CIA大鼠脾細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 水平，有效抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌的NO 和TNF-α[53-54]。

本研究借助基因分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接平臺，對藥物與疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，初步預(yù)測了HBHGT 在IgAN 治療中起關(guān)鍵作用的藥物成分、靶點(diǎn)、通路及其潛在作用機(jī)制，為IgAN 的臨床治療以及用藥提供了參考。 但仍有部分成分-靶點(diǎn)-通路信息缺乏，因此，還需要更高質(zhì)量的生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理信息平臺來提供支撐，需要更多的細(xì)胞或動物實驗來給予驗證和支持。